韧皮部特异性启动子研究概况

于文静，王玉富，邱财生，郝冬梅，薛召东

（中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410205）

亚麻是一种重要的韧皮纤维作物，亚麻纤维具有拉力强、柔软、细度好、导电弱、吸水散水快、膨胀率大等特点，可纺高支纱，制高级衣料。木质素对亚麻纤维的性能和品质具有较大影响，木质素对于亚麻具有支撑作用，没有木质素亚麻就会倒伏，但在亚麻加工的脱胶过程中，木质素又是难以去除的成分，所以控制木质素合成的量就显得尤为重要。韧皮部特异启动子可以驱动下游基因在植物的韧皮部特异表达，如果利用韧皮部特异启动子构建木质素生物合成中的某个关键酶基因的表达载体，再转到植物中就可以控制该基因的表达活性，这样对于纤维部分的木质素生物合成也有所控制。

启动子是一段供RNA聚合酶定位用的DNA序列，通常位于基因的上游。一旦RNA聚合酶定位并结合在启动子上即可启动转录过程，因此启动子是基因表达调控的重要顺式元件，它与RNA聚合酶以及其他蛋白辅助因子等反式元件的相互作用是启动子调控模式的实质[1，2]。随着基因工程的发展，常常需要构建一种能高水平表达异源蛋白质的表达载体。启动子对外源基因的表达水平影响很大，它是基因工程表达载体的重要元件。因此研究启动子的克隆方法，对研究基因表达调控和构建表达载体至关重要。近年来又有许多改进的克隆启动子的方法获得了多方面的成功，本文就近年来改进的启动子克隆方法作一下综述，以期促进对启动子分离技术的应用。

1 植物启动子的结构与分类

1.1 植物启动子的结构

真核生物启动子的结构特征是：1）+1处的转录起始位点（帽子位点），一般为A，两边通常为嘧啶碱基[3，4]。2）以-25～-30位为中心的区域，其富含AT序列，称为TATA_box，它是启动子主要的功能性成分，TATA_box的序列为TATA[A/T]A[A/T]。TATA_box是RNA聚合酶Ⅱ识别的位点，也是一些反式作用因子与DNA相互作用的位点之一。TATA_box指导RNA聚合酶结合到启动子上，使其在正确的位置开始转录。3）以转录起点-75位为中心的CAAT_box，一般位于-70～-300位的范围内，可以增强转录效率，其保守序列为GC（C/T）CAATCT，没有CAAT_box基因的，以一个类似的AGGA_box来代替。CAAT_box可以从正反两个方向起作用，并且与其它顺式元件有协同作用。植物中与CAAT_box结合的转录因子可能也是一种异源三聚体复合物，但不同的是植物CAAT_box复合物的亚基是由多个基因编码的。因此植物中可能存在多种CAAT_box结合复合物和组合调控（combination control）方式[5]。（4）启动子的一个显著特点是富含A/T。一般认为A/T碱基对容易解链，有利于转录的起始。在豌豆和菜豆等[6，7，8，9，10]植物基因的启动子研究中发现，A/T富含序列既可以作为正调控因子也可以扮演负调控因子的角色。（5）除了A/T富含序列外，在启动子上还存在着一些与反式因子相互作用的正负调控序列。

1.2 启动子的分类

习惯上，将植物基因的启动子按其基因的表达方式分为组成型启动子（即基因的表达不受时空限制和某种物质的诱导而在植物中表达出来）、诱导型启动子（其基因的表达受某种物质的诱导，没有诱导物存在，基因表达水平很低甚至没有）和组织或器官特异性启动子（其基因的表达分布在植物的某个组织或器官中）。

最常用的一种启动子是花椰菜花叶病毒（CaMV）的35S启动子。植物激素、植物生长发育和环境信号的复杂交互作用调控植物的生长发育[11]。诱导型启动子能控制基因在特定时期、特定部位表达，这既避免了目的基因在寄主细胞内高表达对寄主细胞生长的影响，又可使寄主细胞对诸如热激、光照、创伤等特定的环境信号作出反应。因此，强诱导型启动子对于建立一个高效、实用的表达系统是非常重要的。

基因在不同发育阶段及组织中表达是植物本身生长发育的需要。基因的特异表达关键在于其启动子中特异的顺式因子及一些特异的转录因子的不同。已有很多报道是关于组织特异性启动子的研究，矮牵牛（Petunia hybrida Vilm）的花特异表达启动子SA[12]，种子中特异表达的启动子PsGNS2启动子[13]，植物细胞顶尖生长特异的IRE启动子[14]，表皮特异的表达的CUT1启动子[15]，富甘氨酸蛋白质基因（GRP1.8）的木质部细胞特异性表达的启动子[16]，韧皮部细胞中表达的玉米蔗糖合成酶基因启动子Sh[17]。

2 植物启动子克隆的几种方法

2.1 利用启动子探针载体筛选启动子

启动子探针型载体是一种有效、经济、快速分离基因启动子的工具型载体，其包含2个基本部分：转化单元和检测单元。其中，转化单元含复制起点和抗生素抗性基因，用于选择被转化的细胞；检测单元则包括1个已失去转录功能且易于检测的遗传标记基因以及克隆位点[41]。这种方法在微生物中应用得比较多，在植物中主要是利用PCR技术。

2.2 利用PCR技术克隆启动子

即根据发表的基因序列，设计引物，克隆基因的启动子，由于PCR法简便快捷，近年来人们较多采用此方法克隆基因启动子。彭仁旺等[18]根据已报道的序列设计引物，通过PCR扩增，从烟草中克隆了花药特异表达。蒋浩等[19]用PCR方法从美洲黑杨基因组DNA中扩增到了BSA基因启动子片段基因TA-29的启动子。上述的PCR方法简便、快捷、操作简单，是人们较为广泛使用的技术。但是这种方法是在建立了知道基因的全序列的基础上，只有这样才能根据已知序列设计引物，扩增出目的基因的启动子，对于未知基因序列的启动子克隆，还需要利用其他的方法进行研究。

2.3 环状PCR

环状PCR包括I-PCR（Inverse-PCR）和P-PCR（Panhandle-PCR）。这两种PCR都是根据一端已知序列设计的嵌套式引物进行PCR。

2.3.1 I-PCR

I-PCR是1988年由Triglia[20]最早提出的一种基于PCR的改进的染色体步行方法。PCR的实验程序包括，基因组DNA经酶切后用T4DNA连接酶进行自连接，产生环状DNA片段；以环化产物为底物，用根据已知片段设计的反向引物进行PCR扩增，从而得到含有未知片段的扩增产物。

2.3.2 P-PCR

P-PCR是由Jones等[21]提出的利用末端反向重复序列与已知序列互补配对形成环状单链模板，有效增强了引物与模板结合的特异性。反应需要3个根据已知序列设计的引物，3个引物在已知序列内呈线性排列，其中第3个引物可作为接头使用，可与已知序列互补配对形成锅柄状单链模板。其过程为，首先酶切基因组DNA，产生5'或3'粘末端，然后连接上合适的接头（primer 3），连接好后最好用核酸外切酶I除去多余的接头，由于连接上的接头与已知序列是反向重复序列，变性后的DNA单链可退火形成锅柄状单链模板，之后分别用3个单引物进行3次PCR扩增，能有效地扩增2～9kbp的大片段未知序列。

2.4 利用载体或接头的染色体步行技术克隆基因启动子

这类方法的第一步都是酶切基因组DNA，连接载体或接头，既可以用pUCl8等质粒载体，也可以使用λDNA等噬菌体载体，只要选用的载体带有合适的酶切位点；同样根据实验需要，接头既可以是双链也可以是单链，然后根据基因组DNA序列设计的特异引物和载体的通用引物或接头序列进行扩增。

2.4.1 利用载体PCR

Shyamala等[22]利用的单特异性引物PCR（SSP-PCR）对以小鼠伤寒杆菌组氨酸转运操纵子为起点进行连续步行。以M13mpl8RF DNA为载体。用PstI和AraI酶切基因组DNA，PstI和XmaI酶切载体DNA，然后连接基因组片段和载体片段，用根据基因组DNA序列设计的特异引物和载体的通用引物进行扩增，由于非特异片段没有单特异引物结合的位点，即使有载体连到非特异片段，也无法得到大量扩增，而使特异片段得到有效扩增。

2.4.2 利用接头PCR

王新国等[23]利用衔接头的方法，设计出了位于单链DNA两端互补的颠倒末端重复序列，增加了反应的特异性，在胡萝卜II型转化酶基因启动子的克隆方面取得了新的进展。首先将胡萝卜基因组DNA分别用PvuI、SmaI、DraI、EcoRV四种酶切，并设计了1个衔接头长链序列和1个衔接头短链序列，并在衔接头短链的3'末端带有1个氨基的衔接头，能够阻止聚合酶催化的衔接头短链的延伸，同时衔接头的长链和短链之间是反向重复序列。将酶切片段与此衔接头连接，取连接产物做模板，以衔接头引物和基因特异引物做PCR，在首轮PCR中只有限定的远端基因特异引物有结合位点，当基因特异引物延伸产生的DNA链通过衔接头时，才能产生衔接头引物的结合位点，PCR才能以衔接头引物和基因特异引物进行指数扩增。而另一方面，如果非特异合成产生了DNA两端都有双链衔接头序列的PCR产物时，这种PCR产物在每次变性后，单链DNA末端的衔接头反向重复序列将形成锅柄结构，此结构比引物-模板杂交更稳定，能抑制非特异序列的指数增长。最后得到主要的PCR产物为3.4kb、1.3kb、0.6kb和0.4kb。将EcoR V-衔接头体系的PCR产物克隆、测序、同源性比较，得到1个新的胡萝卜II型转化酶基因启动子序列，它含有类似于TATA box和CAAT box的元件，在启动子的远上游区域含多个AT富含区，该启动子的发现对于研究植物中的糖代谢具有重要的意义。

2.5 TAlL-PCR

很早就有用随机引物的PCR，但由于无法有效地控制由随机引物引发的非特异产物的产生，所以一直未能广泛应用。近年来由Liu等[24]设计的TAIL-PCR（Termal Asymmetric Interlaced PCR）又叫热不对称交错PCR，则解决了这个问题，后来有研究表明，经改良过的TAIL-PCR成功地从突变体中克隆到外源插入基因的旁侧序列，从而为启动子的克隆提供了有效的新方法。在利用特异引物和随机引物进行PCR中一般有3种产物生成：（1）由特异性引物和简并引物扩增出的产物；（2）由同一特异性引物扩增出的产物；（3）由同一简并引物扩增出的产物。在TAIL-PCR反应中，其中后2种目标产物可以通过以嵌套的特异性引物进行的后续反应来消除。

TAIL-PCR的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物（specialprimer，简称sp1，sp2，sp3，约20bp），用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物（Arbitrarydegenerate primer，AD，约14bp）相组合，以基因组DNA为模板，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物。

TAIL-PCR共分3次反应。第一次反应包括5次高特异性、1次低特异、10次较低特异性反应和12个热不对称的超级循环。5次高特异性反应，使sp1与已知的序列退火并延伸，增加了目标序列的浓度；1次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上；10次较低特异性反应使2种引物均与模板退火，随后进行12次超级循环[25，26]。

经上述反应得到不同浓度的3种类型产物：特异性产物（I型）和非特异性产物（II型和III型）。第二次反应将第一级反应的产物稀释1000倍作为模板，通过10次热不对称的超级循环，使特异性产物被选择地扩增，而非特异产物含量极低。第三次反应又将第二次反应的产物稀释作模板，再设置普通的PCR反应或热不对称超级循环，通过上述3次PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列。

TAIL-PCR不需要PCR前的任何DNA操作，避免了环化和连接，速度快，特异性强，效率高，灵敏，但是其步骤比较复杂，实验技术要求也较高[26]。

3 韧皮部特异启动子的研究

韧皮部特异性启动子在植物、植物病原物（细菌、病毒等）中都存在，凭借该类启动子，病原物可利用韧皮部运输的养分完成自身的生长繁殖，或造成系统侵染[29]。韧皮部特异性启动子区别于其它类型启动子的一个显著特点是在该类启动子序列中存在一段与启动子的韧皮部特异性表达有关的基序。将几种韧皮部特异性启动子的序列进行比较，发现13nt的保守序列T/ATAAGT/AACGAAT/CC/A，可能与韧皮部特异表达有关，推测（G/C）（G/C）TATG序列可能也与启动子的韧皮部特异性及启动子的活性密切相关[32]。这里介绍几个植物来源的韧皮部启动子。

3.1 笋瓜韧皮部蛋白（PP2）基因启动子

PP2蛋白是葫芦科植物韧皮部中大量存在的蛋白，一种独特的结合几丁质的凝集素，具有韧皮部组织特异性。Bostwick等[30，31]对笋瓜幼苗PP2蛋白的原位免疫杂交表明该基因产物特异地定位于韧皮部伴胞中。蒋浩等[33]根据已知的笋瓜PP2基因全序列，扩增出PP2基因启动子的987bp片段。分析发现该启动子区有富含A/T的区域和富含A/T的重复序列，将该启动子-GUS转化烟草，发现GUS基因在叶柄、茎、叶、根的韧皮部都显著表达，还通过基因组DNA步移法扩增克隆了南瓜PP2基因启动子（npp2）序列后，并对该启动子作了缺失分析，在此基础上构建了增强型npp2启动子，该启动子和原启动子比较GUS活性明显提高，且仍然为组织特异性表达。胡桂兵等[34]根据PP2基因的启动子序列扩增出目标片段后，构建了含绿色荧光蛋白报告基因新植物表达载体。

3.2 玉米蔗糖合酶-1基因启动子

玉米蔗糖合酶-1（sucrose synthase Sh）基因编码蔗糖合成酶1同工酶，这种酶在玉米种子的胚乳中高水平表达，在根中表达甚微，在绿色组织和花粉中无表达。对该基因启动子-GUS融合基因在转基因烟草中的研究表明，该启动子具有韧皮部组织特异表达的活性，而在其它营养组织细胞（表皮、木质部、髓和皮质细胞）中均无GUS表达的活性。

3.3 油菜（Brassica napus）伸展蛋白基因启动子

伸展蛋白即富含羟脯氨酸-糖蛋白（HRGP），是一类主要的细胞壁蛋白。它的主要特征是具有五肽（ser-pro-pro-pro-pro）的重复基元。Shirsat等[35，36]将该基因启动子的1.0kb的片段与GUS基因融合后转入烟草和油菜，比较了两者表达的异同，在转基因烟草中GUS基因的表达定位于根部周层与侧根起始有关的细胞中，在叶中未检测到GUS基因的表达。在转基因油菜中，GUS基因的表达定位于根部维管组织的韧皮部细胞，而在侧根分生组织及周层与侧根形成有关的细胞内无GUS表达。

3.4 杨树树皮储藏蛋白基因启动子

树皮储藏蛋白BSP是一多基因家族编码的蛋白。蒋浩等[19]用PCR方法从美洲黑杨基因组中DNA扩增并克隆到了BSP基因启动子片段，该启动子具有富含A/T的区域和富含长达19bp的A/T重复序列，这种结构特征可能有利于转录的起始，在大多数植物启动子中A/T富含序列都和基因转录活性的正调控有关。它与GUS融合基因转化烟草表明该启动子可介导GUS基因在烟草韧皮部组织特异表达的特点。在BSP蛋白家族中，bspA基因已被克隆并测序。Zhu等[46]将bspA启动子的2.8kb与β-葡萄糖醛酸酶基因（uidA）融合后转化杨树，在转基因杨树中观察到GUS活性定位于韧皮部。

除了上述的几种植物来源韧皮部特异启动子，还有已报道的另一些韧皮部特异启动子，如拟南芥蔗糖合成酶基因（ATASUS1）启动子、杨树咖啡酰辅酶A-3-O-甲基转移酶基因（CCoAOMT）启动子等。在植物细胞分化过程中韧皮部特异性启动子对某些特定基因的表达调控及韧皮部的形成可能起着重要作用，所以研究这类启动子的特殊调控功能还将会有助于人们对细胞分化分子基础的了解。

目前韧皮部特异启动子在亚麻中的研究还很少，有关种子特异启动子的研究在亚麻中有报道[52]，而且主要是研究其它植物种子特异启动子在亚麻中的表达分析，亚麻植物本身的特异启动子还没有得到。

4 讨 论

目前，启动子克隆方法绝大多数是建立在PCR的基础上的染色体步行技术，利用启动子克隆的方法不仅可以克隆到基因的启动子，同时还可以用于克隆cDNA的全长[38，45，46]。研究真核基因启动子的转录调节功能的鉴定程序是，应用一系列的突变技术对目的基因启动子序列作体外诱变处理，然后转移到适当的受体细胞中做进一步的功能分析。常用的体外突变技术有单侧缺失突变（one-sided deletion mutagenesis）、内部缺失突变（internal deletion mutagenesis）、衔接物扫描突变（linker-scanningmutagenesis）以及定点突变（site-directed mutagenesis）等[51]。对于韧皮部特异启动子在亚麻植物中的研究，目前理论和实验基础还不完善，所以首先是要进行亚麻基因组的研究，以及找到可以在韧皮部特异表达的基因，测出这些基因的全长，再利用反向PCR技术克隆出韧皮部特异性启动子，或者用上述的其他克隆启动子的方法得以实现韧皮部特异启动子的克隆。在转录水平调控基因在不同的组织或器官中表达是生物工程研究的一个方向和热点，韧皮部特异性启动子的不断发现与研究，不仅使人们对组织特异启动子的结构有更深入的认识，而且还可为组织分化的研究及植物基因工程提供有应用价值的新型启动子元件。

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