高效液相色谱法检测福美双在蔬菜及土壤中的残留

孟凡立，崔兆丰，王志坤，李文滨*

（1.东北农业大学大豆研究所，哈尔滨 150030；2.抚远县出入境检验检疫局，黑龙江 抚远 156500）

福美双是一种具有保护作用的硫代氨基甲酸酯类杀菌剂，化学名称为二硫化四甲基秋兰姆。其抗菌广谱，对黄瓜霜霉病、番茄、瓜类猝倒病、立枯病、禾谷类白粉病、黑穗病和多种作物的苗立枯病等均有较好的效果，是良好的种子处理剂和土壤处理剂。国外文献报道的检测方法中有GC法、GC-MS法、原子吸收法及HPLC-MS法等[1-4]，国内多使用检测二硫代氨基甲酸酯的水解产物-CS2，即通过酸性水解使福美双分解为CS2，从而检测蔬菜中福美双的残留量[1-2]。二硫代氨基甲酸酯类杀菌剂根据化学结构的不同可分为3类，分别为二甲基二硫代氨基甲酸酯类（福美双、福美铁等）、乙撑双二硫代氨基甲酸盐类（代森锰锌、代森锌等）和丙烯基双二硫代氨基甲酸酯类（丙森锌），此3类物质均可水解产生CS2，故以CS2法进行福美双残留量测定缺乏专一性，且测定结果的稳定性和重现性也不好。根据Gustafsson等报道的在福美双含量分析中采用的衍生化原理[5]，上述3类物质能够产生不同的衍生产物，因此能够分别检测这3类残留。本研究利用上述衍生原理，建立了福美双在黄瓜、番茄和土壤中残留检测方法，为进行福美双在复杂基质中的残留检测提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1100（G1315A DAD）型高效液相色谱仪；THZ-82A气浴恒温振荡器；申胜R-201型旋转蒸发仪；SHZ-D（III）型循环水式真空泵；SPS 202F型电子天平；金怡TDL-50台式大容量离心机；便携式酸度计（Checker-Hanna Instruments）；涡旋式振荡器（VTX-3000L）；Millex针头式过滤器，0.45 μm。

福美双标样（纯度99%，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；L-半胱氨酸盐酸无水物（99%，上海生工生物工程有限公司）；EDTA二钠二水合物（99%，Gene-Tech Co.,Ltd.）；四丁基硫酸氢铵（99%，ACROS Organic）；甲醇、乙腈为UV级纯；二氯甲烷、正己烷、氯化钠、碘甲烷等均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 样品的处理

将采来的土壤样本去除杂草、碎石等，充分搅拌混匀；黄瓜及番茄样本先切成片，再经组织捣碎机粉碎后，混合均匀。所有样本低温保存（-20℃）。

1.2.2 溶液配制

将100 g·L-1半胱氨酸盐酸盐与186.9 g EDTANa2及2 L蒸馏水、36 g NaOH于烧杯中溶解，配制成pH 9.5～9.6的L-半胱氨酸盐酸盐和EDTA-Na2混合溶液备用（下称溶液Ⅰ）；配制含有0.05 mol·L-1碘甲烷的二氯甲烷-正己烷（1：1，体积比）混合溶液备用（下称溶液Ⅱ）。

准确称取福美双标样0.0505 g（准确至0.2 mg）于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配成浓度为1 000 mg·L-1的标样储备液，于冰箱4℃储存。

1.2.3 样品的提取及衍生化

称取20 g处理好样品于250 mL三角瓶中，加入100 mL溶液Ⅰ，密封，室温条件下（25±5℃）使用空气浴机械振荡器在130 r·min-1下，剧烈震荡10 min转移至离心管中，再在4 000 r·min-1下离心5 min转移上清液于250 mL三角瓶中；样品残渣再用50 mL溶液Ⅰ涡旋2 min提取，步骤同上，合并上清液于250 mL三角瓶中，搅拌下用6 mol·L-1的盐酸调 pH 8.0 加 5 mL 0.41 mol·L-1的四丁基硫酸氢铵水溶液，调pH 7.0搅拌下加入40 mL溶液Ⅱ，剧烈震荡10 min，静置10 min弃水层，转移上层有机相于100 mL离心管中，于4 000 r·min-1下离心5 min。弃水层，有机相用少量无水硫酸钠干燥，上清液转移至100 mL平底烧瓶中加入5 mL 2-丙二醇-二氯甲烷（1：4，体积比）溶液，于30℃水浴中旋蒸浓缩，残留物用1 mL甲醇定容，经0.45 μm过滤器后进行HPLC检测。

1.2.4 仪器条件

色谱柱：Thermo BDS HYPERSIL-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：35 ℃；流速：1.0 m·L-1；进样量：20 μL；DAD波长选用272 nm；流动相为甲醇-乙腈-水（20：28：52，体积比）；仪器为四元泵配置，采用等梯度流动相洗脱。

2 结果与分析

2.1 标准曲线制作

在1.2.4的色谱条件下，黄瓜、番茄及土壤样品中福美双甲基化衍生物的色谱峰与溶剂峰及干扰峰完全分离，结果见图1～4。化合物的保留时间为6.1～6.3 min。

准确配制 1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mg·L-1的福美双标准溶液，按照上述方法（见1.2.3）进行操作。在1.2.4的色谱条件下进样，并以福美双衍生物的峰面积-福美双浓度绘制标准曲线。线性回归方程为y=26.611x-7.9339，r2=0.9996。可见在1～50 mg·L-1范围内响应峰面积与药物浓度呈良好的线性关系。

图1 福美双标样的液相色谱Fig.1 HPLC chromatogra h of thiram standard sample

图2 土壤空白及0.5 mg·kg-1福美双标样添加液相色谱Fig.2 HPLC chromatograph of blank soils sample and fortified sample with thiram of 0.5 mg·kg-1

图3 黄瓜空白及0.5 mg·kg-1福美双标样添加液相色谱Fig.3 HPLC chromatograph of blank cucumber sample and fortified sample with thiram of 0.5 mg·kg-1

图4 番茄空白及0.5 mg·kg-1福美双标样添加液相色谱Fig.4 HPLC chromatograph of blank tomato sample and fortified sample with thiram of 0.5 mg·kg-1

2.2 精密度、准确度和重现性

采用同一供试样品溶液，在相同色谱条件下，连续进样5次，测定其峰面积，多次测定的峰面积相对标准偏差为1.7%，说明本方法有较好的精密度。

在空白样品中准确加入一定量的福美双标准品，按同样的操作步骤进行提取、衍生、测定，计算回收率，结果见表1。在黄瓜、番茄和土壤中福美双的添加浓度在0.05～2.0 mg·kg-1范围内，平均回收率分别为74.3%～93.9%、85.7%～102.0%和83.5%～101.8%，变异系数分别为 0.7%～6.3%、1.8%～4.5%和1.6%～5.3%，均在农药残留测定所允许的范围内（回收率：70%～120%，变异系数≤15%），表明该方法准确度和重现性满足残留分析要求。

表1 样品中福美双标样添加回收率结果（n=5）Table 1 Average recovery and relative standard deviation of thiram in samples at 0.05～2.0 mg·kg-1fortification level(n=5)

分别以噪音信号的3倍和10倍确定方法的最低检出限（LOD）为 0.02 mg·kg-1，最低检测浓度为0.05 mg·kg-1（均以福美双含量计）。

3 讨论

目前国内关于福美双在蔬菜或土壤中的残留检测方法主要有分光光度法（商检行业标准SN 0525-1996）、GC-CS2法（地方标准 DB11/T 379-2006）、二氯甲烷萃取法[6-8]。其中分光光度法检测存在假阳性情况，且检出限过高（0.3 mg·kg-1）已不能满足当前福美双残留检测要求。GC-CS2法最低检出限为0.005～0.02 mg·kg-1，但是由于 CS2在食品（如大米、蔬菜等）及土壤样本中普遍存在，这会严重干扰福美双痕量残留的定量检测。二氯甲烷萃取法操作较简便，但经研究表明，二氯甲烷萃取过程中乳化严重，且回收率偏低（＜70%）。本方法利用福美双在碱性EDTA-Na2溶液中降解，再经甲基化处理，最后由HPLC测定该甲基化产物，方法简单、可靠。我国规定二硫代氨基甲酸盐（酯）类杀菌剂在果蔬中最大残留限量（MRL）为 2 mg·kg-1，欧盟为 0.5～3 mg·kg-1，该方法均满足检测要求。

4 结论

本试验采用甲基衍生化-HPLC法，建立了福美双在蔬菜及土壤中的残留检测方法，方法回收率为74.3%～101.8%，变异系数为0.7%～6.3%，符合我国农药残留检测要求。本方法无需复杂的净化处理，直接使用液相色谱检测，即可达到残留分析的目的，且简单易行，结果可靠。

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