穿心莲内酯对巨噬细胞环氧化酶2及其产物表达的影响

李 明 陈伟强 李 岩*

1 广东省广州市药学院病理生理学教研室（510006）

2 广东省广州中医药大学基础医学院微生物学与寄生虫学教研室（510006）

前列腺素（prostaglandins，PGs）是一种与炎症紧密相关的重要介质，环氧化酶（cyclooxygenase，COX）为PGs生物合成的重要限速酶。COX存在两种异构体，其中COX-2为诱导酶，通常不表达或低表达，在遇到外界刺激如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、致癌基因等时可在巨噬细胞、滑膜细胞、内皮细胞等细胞中高表达，参与机体的炎性反应[1]。越来越多的证据表明，COX-2与炎症性疾病的关系非常密切，在多种炎症疾病和动物炎症模型的炎性渗出液中均发现COX-2 mRNA和蛋白表达的增强，抑制COX-2可有效减轻炎症损伤[2,3]。

穿心莲为爵床科植物穿心莲属植物穿心莲干燥地上部分，作为常用中药，具有清热解毒、凉血消肿等功效。穿心莲内酯是穿心莲的主要药效成分，有研究表明，穿心莲内酯有显著的抗炎活性，对大鼠蛋清蛋白、角叉菜胶足趾注射致炎模型均有明显的抗炎作用[4]。本研究从对COX-2及其产物PGE2表达的影响角度出发，探讨穿心莲内酯抗炎活性的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

穿心莲内酯（四川广汉市维康植化有限公司）；细菌内毒素（LPS，美国Sigma公司）；PGE2Elisa检测试剂盒（美国R&D公司）；蛋白提取试剂盒、ECL化学发光试剂盒（美国Pierce公司）；抗COX-2和β-actin抗体（美国Santa Cruze公司）。蛋白电泳仪、电转仪、杂交箱和酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 细胞培养及干预实验

小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞为由本室保存。用DMEM培养基（含10 %胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素) 5 %CO2，37℃条件下传代培养。取生长状态良好的RAW264.7细胞，0.25%胰酶消化，用DMEM培养基调整细胞浓度为1×106/mL，每孔1mL接种到24 孔培养板内，待细胞生长至80%融合后，加入不同浓度的穿心莲内酯（终浓度分别为1、10、50μmol/L）孵育1h，然后加入LPS（终浓度1μg/mL）进行刺激。实验分组如下：正常对照组、穿心莲内酯组、LPS组和穿心莲内酯加LPS组。根据实验要求在相应时间点取细胞或培养上清进行后继实验。

1.3 PGE2浓度测定

细胞加入LPS继续培养18h，收集各处理组细胞培养上清液，用PGE2Elisa试剂盒检测上清液中PGE2的含量。操作步骤按试剂盒说明书完成。

1. 4 COX-2蛋白表达水平的测定

细胞加入LPS后继续培养24h，用冰冷的PBS终止刺激，按说明书提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取50μg样品煮沸变性后进行SDS-PAGE电泳（5 %的浓缩胶和10 %的分离胶），转膜，5%的脱脂奶粉37℃封闭1h，加抗COX-2或抗β-actin一抗(1∶1000) 4℃孵育过夜，洗膜，加辣根过氧化物酶标记的相应二抗稀释液(1∶2000)，37℃下孵育1h，ECL法显影。

1.5 统计分析

2 结 果

2.1 穿心莲内酯对PGE2生成的影响

PGE2Elisa检测结果显示，在正常情况下巨噬细胞RAW 264.7培养上清中PGE2含量极低，用100μmol/L浓度的穿心莲内酯单独作用，对PGE2的生成无明显影响，与空白对照组比较P＞0.05。1μg/mL LPS刺激可以显著促进小鼠巨噬细胞RAW 264.7的PGE2合成，与空白对照组比较P＜0.01。穿心莲内酯可在1～50μmol/L范围内呈浓度依赖性抑制LPS诱导的PGE2生成，与LPS组比较有显著性差异。结果见表1。

表1 穿心莲内酯对PGE2分泌的影响 （±s，n=6）

表1 穿心莲内酯对PGE2分泌的影响 （±s，n=6）

与对照组比较，a)P＜0.01；与LPS组比较，b)P＜0.05，c)P＜0.01

分组 PGE2（pg/mL）正常对照组 45.67±15.12穿心莲内酯组 42.33±23.44 LPS组 331.17±38.18a LPS+1μmol/L穿心莲内酯组 280.00±33.62b LPS+10μmol/L穿心莲内酯组 241.33±40.89c LPS+50μmol/L穿心莲内酯组 210.17±31.63c

2.2 穿心莲内酯对COX-2表达的影响

Western Blot结果显示，在正常情况下巨噬细胞COX-2表达很低，50μmol/L穿心莲内酯对COX-2表达无明显影响。当用LPS刺激后，巨噬细胞COX-2 蛋白表达明显增高。穿心莲内酯可以抑制LPS诱导的巨噬细胞COX-2表达，各处理组COX-2表达水平明显低于LPS组，结果见图1。上述结果表明穿心莲内酯抑制巨噬细胞PGE2生成与其抑制COX-2表达有关。

图1 穿心莲内酯抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞COX-2表达

3 讨 论

PGs是一种与炎症紧密相关的重要介质，COX为PGs生物合成的重要限速酶。COX存在两种异构体，分别是COX-1和COX-2。COX-1为正常表达酶，介导细胞的正常生理功能，调节机体的生理平衡与稳定；COX-2为诱导酶，静息状态下正常组织中无表达或弱表达，当受到细胞内外各种因素刺激时则迅速合成，表达增强[1]。在炎性肠病患者的肠道上皮细胞、慢性支气管炎大鼠的肺组织和动脉粥样硬化小鼠的斑块局部就发现COX-2 的高表达，同时伴随代谢物水平PGE2浓度增加，而抑制COX-2能有效改善病变程度[2,3]，说明COX-2与炎症性疾病的关系非常密切。目前临床上最常用的抗炎、镇痛药物之一的非甾体类解热镇痛药物就是通过抑制COX-2的活性来发挥抗炎作用的。但NSAID存在肾脏毒性及消化道不良反应，在一定程度上限制了其应用[5]。而正在研究开发特异性COX-2抑制剂（celecoxib、rofecoxib等），虽然降低了不良反应发生率，但其安全性仍有待进一步研究和探讨。

国内外学者在对传统中药研究中发现，很多具有良好抗炎作用的中药可通过直接抑制COX-2的活性或抑制COX-2 mRNA及蛋白表达等方面来干扰其功能，影响PGs的合成来发挥抗炎效应[6,7]。清热解毒类药物穿心莲具有清热解毒、凉血消肿等功效，是常用的传统抗炎中药之一。穿心莲内酯为其主要药效成分，在大鼠炎症模型上表现出明显的抗炎活性。穿心莲内酯是否通过抑制COX-2的表达及其产物PGE2的生产来发挥抗炎效应呢？我们首先用LPS刺激巨噬细胞，发现LPS可以刺激巨噬细胞COX-2和PGE2的高表达，然后用Western Blot法检测穿心莲内酯干预对LPS诱导的巨噬细胞COX-2蛋白表达的影响，结果发现穿心莲内酯能有效抑制COX-2的表达；用Elisa法测定细胞培养上清中COX-2主要产物PGE2含量，结果发现穿心莲内酯处理后，巨噬细胞培养上清中的PGE2含量明显下降。根据这些结果，我们认为穿心莲内酯通过抑制COX-2表达，进而抑制炎性因子PGE2的产生，发挥抗炎作用。本研究为穿心莲内酯抗炎作用的阐明和穿心莲内酯的进一步应用提供了实验基础。

[1]Williams CS,MannM,Dubois RN,et al.The role of cyclooxygenases in inflammation,cancer,and development [J].Oncogene,1999,18(55):7908-7916.

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[5]Mamdani M,Rochon PA,Juurlink DN,et al.Observational study of upper gastrointestinal haemorrhage in elderly patients given selective cyclo-oxygenase-2 inhibitors or conventional nonsteroidal anti-inflammatory drugs[J].BMJ,2002,325(7365): 624-627.

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