眼镜蛇伤大鼠多项指标动态变化与抗蛇毒血清的时效关系*

杨嘉琳， 董伟华， 孔天翰△

(1广州医学院第三附属医院，广东 广州 510150;2广州医学院病理生理教研室，广东 广州 510182)

舟山眼镜蛇(Naja atra Cantor)咬伤是我国南方最常见的蛇伤之一，尤其在广东、广西地区位于毒蛇咬伤的首位。目前，蛇伤后的分期、分型尚缺乏实验室检查的有关特异性指标，故临床上大多据患者的系统症状(神经、呼吸、消化、泌尿及血液系统等)及局部体征(出血、水肿、疼痛等)将蛇伤分为轻型、重型(功能障碍期)及危重型(功能衰竭期)［1］。抗蛇毒血清是治疗蛇伤的首选特效药，蛇伤后2 h内应用抗蛇毒血清能明显缩短病程和减轻脏器损害，可获得最佳的临床疗效［2］;亦有报道于毒蛇咬伤6－8 h内应用抗蛇毒血清，96%以上病例可在1－2 d即可治愈出院［3］。由于蛇毒进入机体后有特定的代谢过程，当血液中游离蛇毒素含量低于特定值以后，再输入抗血清非但不足以提高疗效，相反还增加严重过敏反应的风险。另外，作为生物药品的抗血清在使用过程中还存在着诸多不足，如难保管、易变质及价格昂贵等，因此系统研究抗血清使用的时效性，以确定最佳使用时段及无效时段的下限，对指导正确、合理使用抗蛇毒血清，提高临床疗效有重要意义。本实验用不同挑战剂量(2 LD50［4］、4 LD50［5］)舟山眼镜蛇毒以建立大鼠蛇伤模型，通过系统观察蛇伤后大鼠相关器官功能动态变化，依据多项实验室指标结果，提出了重度蛇伤后分期的假设，同时探讨了抗血清对动物保护时效性与相关实验室指标变化的关系，为优化眼镜蛇伤的临床治疗方案、动态监测抗血清应用的实际疗效提供实验依据。

材料和方法

1 主要仪器设备

蛇毒取毒器 (专利号为 ZL200420046279.9，由广州蛇毒研究所自行研制);Sychron LX20全自动生化分析仪(Beckman Coulter);Sysmen CA－600全自动凝血分析仪(日本希森美康公司);LD4－低速离心机(北京医用离心机厂);i－STAT多功能血液分析仪(雅培公司);真空采血管。

2 主要试剂

2.1 蛇毒的制备 成年舟山眼镜蛇购自广州白云区茶山福蛇场，用自制的蛇毒取毒器取毒，黏稠而淡黄色毒液按1∶4比例加入自制的蛇毒保护液(可避免细菌、蛋白酶及环境高温对蛇毒抗原性的破坏)稀释，3000×g离心30 min去沉淀，－20℃冷冻，真空、低温干燥为冻干粉，4℃密闭保存。生理盐水配成0.57 g/L溶液，分装后放于－20℃冷冻备用。

2.2 抗蛇毒血清 精制抗眼镜蛇毒血清(1000 IU/瓶，上海赛伦生物技术有限公司，批号为20070701)。

2.3 其它试剂 肝素、2%戊巴比妥钠、生理盐水;cTnl EG3+测试片。

3 蛇伤模型制备

动物由广东省实验动物中心提供，SPF级SD大鼠，体重(230±20)g，雄性，合格证号为粤监证字2007A003。按给药的不同分为对照组、4 LD50蛇毒和2 LD50蛇毒3组，2个蛇毒剂量分别按2.544 mg/kg(4 LD50)、1.272 mg/kg(2 LD50)于背部脊柱一侧胸廓下缘皮下注毒0.1 mL，剩余的蛇毒全部以肌下5－10 mm平均注入左、右腓肠肌内。

4 蛇伤多项指标动态观察

4.1 生化检测 取4 LD50蛇伤模型大鼠分为0、20、40、60、80、100、120 min 7 组，另取 2 LD50蛇伤模型大鼠分为 0、20、40、60、80、100、120、140 min 8 组，每组10只。注毒后立即开胸取血者为0 min组，其余组取血与注毒后相应时间对应。每只大鼠直视下心脏取血3 mL装无抗凝试管中并分离出血清，用Sychron LX20全自动生化分析仪检测以下项目:谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)、磷酸肌酸激酶(creatine kinase，CK)、磷酸肌酸激酶同工酶(creatine kinase，CK － MB)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT)、肌酐(creatinine，Cr)、总胆红素 (serum total bilirubin，STB)、间接胆红素(unconjugated bilirubin，UCB)、直接胆红素(conjugated bilirubin，CB)。

4.2 病理检查 上述动物心脏取血后处死，取4 LD50组的右侧大腿肌肉(注毒位置)及心肌行病理检查。

4.3 检测血气分析 取4 LD50蛇伤模型大鼠分为0、20、40、60、80、100、120 min 7 组，每组 10 只。大鼠经2%戊巴比妥钠(2.3 mL/kg)腹腔麻醉，呈仰卧位固定于大鼠手术台上，切开颈前部皮肤，分离左侧颈总动脉，结扎远心端，近心端经硬膜外导管(3F)连接三通头，以少量肝素封管后备用。按不同时间段以2 mL注射器自置管处抽取颈动脉血液0.1－0.2 mL，以cTnl EG3+测试片用i－STAT多功能血液分析仪行血气分析检测，记录结果pH值、二氧化碳分压(pressure of carbondioxide，PCO2)、氧分压(pressure of oxygen，PO2)、碳酸氢根(bicarbonate，HCO3－)、血浆二氧化碳含量(content total plasma，TCO2)、剩余碱(bases excess，BE)、氧饱和度 (oxygen saturation，SO2)。

5 抗血清保护

取4 LD50蛇伤模型大鼠分为血清(40、60、80、100、120 min)及蛇毒对照共6组。40 min组为注毒后40 min经腹腔注射精制抗眼镜蛇毒血清(血清/蛇毒:125 kU/g)，60、80、100 及 120 min 组分别于 60、80、100、120 min注入同量抗血清。统计存活时间、保护率，存活时间超过180 min按存活数(只)计。平均存活时间为死亡时间与存活时间(按＞180 min计)之和的均数;保护率=(蛇毒组死亡率－血清保护组死亡率)/蛇毒组死亡率。

6 统计学处理

结 果

1 蛇伤模型制备

注入2倍LD50蛇毒(1.272 mg/kg)，大鼠平均存活时间(300.0 ±19.2)min;按 0、20、40、60、80、100、120、140 min共8个时点取样进行相关的检测。

注入4倍 LD50蛇毒(2.544 mg/kg)后，大鼠于121－140 min之间的死亡率达到50%;至160 min时，死亡率已达 80%，见表 4。按 0、20、40、60、80、100、120 min共7个时点取样进行相关的检测。

2 生化功能检测

2.1 心、肝酶检测结果

①4 LD50AST、CK、CK－MB于注毒后明显上升，于60 min、120 min时点各出现1峰值，且120 min时点为最高值，80 min时点则为1谷值，40－120 min时点的5个时间段与0 min相比均有显著差异(P＜0.05);其中 CK、CK－MB上升更为明显，其值在120 min时点较0 min时上升6－7倍，对比极显著差异(P＜0.01)。LDH于注毒后20 min已开始上升，于60 min时点出现峰值，之后逐渐下降，120 min时点仅出现轻度上升，见表1、图1。②2 LD50与4 LD50相比心酶未出现2个明显峰值，CK－MB在100 min时点出现峰值，CK在80 min时点出现峰值，之后有所下降，140 min时点再次出现上升，但不及100 min前的峰值高;AST于60－100 min时点出现1平台期，140 min时点达到最高值;LDH于100 min时点出现峰值，之后逐渐下降，未再上升，120、140 min 2个时点与0 min相比有显著差异(P＜0.05)。各心酶的最高值均较4 LD50剂量组记录的最高值低，见表2、图2。

表1 注入4 LD50眼镜蛇毒后不同时点大鼠生化、血气分析指标检测Table 1.The biochemical indicators and blood gas analysis test at different time points after injection of 4 LD50of cobra venom in rats(n=10)

Figure 1.CK，CK －MB and pH curves in 4 LD50group.图1 4LD50组CK、CK－MB和pH 曲线图

表2 注入2 LD50眼镜蛇毒后不同时点大鼠生化指标检测Table 2.The biochemical indicators test at different time points after injection of 2 LD50of cobra venom in rats(n=10)

Figure 2.CK and CK－MB curves in 2 LD50and 4 LD50groups图2 2 LD50和4 LD50组的CK、CK－MB曲线

2.2 肝酶 ALT于注毒后进行性升高，在同种剂量组中其上升幅度不如心酶大。

①4 LD5060 min时点达到第1个峰值，80 min时点有一下降点，之后又再上升，120 min时点达到第2个峰值、亦是最大值;60、120 min两个时点与0 min时点相比有显著差异(P＜0.05)，见表1。

②2 LD50在60－100 min时则出现平台期，于140 min时点升到最高值，但其最高值较4 LD50120 min时点的最高值小，见表2。

2.3 胆红素 4 LD50与2 LD50中均可见STB上升，且有2个峰值:分别于60、100 min 2个时点(4 LD50)以及80、100 min 2个时点(2 LD50)出现。胆红素中的CB、UCB并不是同时升高;CB较UCB升高早，在60 min时点(4 LD50)，80 min时点(2 LD50)出现峰值;UCB则在后期升高，在100 min时点(4 LD50、2 LD50)出现峰值。各组的峰值与0 min时点相比均有显著差异(P ＜0.05)，见表1、2。

2.4 肾功能

①4 LD50血Cr于40、120 min 2个时点各出现1峰值，120 min时点为最高值，60 min期为1谷值。20、100、120 min时点分别与0 min时点对比均有显著差异(P ＜0.05)，见表1。②2 LD50Cr在60 min时点后有轻度上升，但0 min时点与各时点相比均无显著差异，变化不明显，见表2。

3 血气分析

4 LD50:HCO3－、BE、TCO2于注毒后出现下降，且为进行性下降，其中 BE、TCO2中 60、80、100、120 min时点与0 min相比有极显著差异(P＜0.01);pH值则于80 min时点后才出现下降，在此之前能维持相对稳定，20、40、60 min时点分别与0 min组对比均无显著差异(P＞0.05);PCO2于40 min时点开始下降，至60 min时点降至最低值，80 min时点后出现升高，至120 min时点升至最高点;PO2于40 min时点开始上升，40 min时点为最高值，80 min时点后出现下降，至120 min时点降至最低点，见表1、图1。

4 病理检查

4.1 4 LD50大腿肌肉 0 min时点:肌肉纤维结构基本正常，少部分肌束胞浆嗜伊红染色，细胞结构较清晰，横纹可见;20 min时点:部分肌肉纤维节段性变性，肌肉横纹消失，大部分心肌纤维结构无异常肌;40 min时点:细胞浊肿较前(20 min时点)明显，细胞正常与浊肿比例介于1/2－2/3之间，少量淋巴细胞浸润;60 min时点:大部分肌纤维横纹消失，并见部分坏死及淋巴细胞浸润;100 min时点:大部分肌纤维坏死，呈空泡状，并见淋巴细胞灶性浸润;120 min时点:基本上所有肌束均明显浊肿、变性，见图3A－C。

4.2 4 LD50心肌 0 min时点:心肌横纹清晰;20 min时点:少部分心肌纤维浊肿，大部分心肌横纹清楚;40 min时点:心肌横纹消失，胞浆浊肿;60 min时点:心肌纤维广泛浊肿变性，可见凝固性坏死，心肌间见红细胞;80 min时点:心肌细胞广泛变性，可见收缩带;100 min时点:心肌纤维广泛变性、浊肿，可见凝固性坏死;120 min时点:心肌细胞明显变性、浊肿，并见炎症细胞浸润，见图3D－F。

5 抗蛇毒血清保护组

4 LD50注毒后40 min时点施予血清，所有大鼠的中毒症状均不明显，各项生命体征均基本稳定，平均存活时间约120 min，存活率为100%，保护率则为80%，与蛇毒组相比有非常显著差异(P＜0.01);60 min、80 min、100 min 时点血清组存活率、保护率及平均存活时间呈线性下降，与蛇毒组相比差异明显(P＜0.05);而120 min时点血清组的存活率为40%，保护率仅为20%，平均存活时间与蛇毒组非常接近，无显著差异，见表3。

表3 注入4 LD50眼镜蛇毒后不同时点施予抗血清对大鼠存活时间的影响Table 3.After injection of 4 LD50cobra venom in rats，the effecf of giving antivenin on the survival time of rats at different time points(n=10)

讨 论

眼镜蛇属混合类蛇毒，神经毒、血循毒兼有之。其主要毒性成分为神经毒素、细胞毒素、磷脂酶A2(PLA2)等。细胞毒素(cytotoxin，CTX)又称为心脏毒素，对心脏和呼吸有明显毒性;CTX可直接损伤细胞生物膜导致细胞结构破坏、坏死，细胞通透性改变使CK －MB、AST 等释放增多［6］。

从表4可知，在60 min时点时，肝酶、心酶均出现第1个峰值，提示肝脏、心脏功能受损明显。近年来国外的药代动力学研究表明，眼睛蛇毒的各种成分在深部组织中的快速分布时间为22－47 min［7］。而国内对舟山眼镜蛇蛇毒及其相关组份药代动力学研究表明，其在哺乳动物体内的快分布相半衰期(T1/2)为40 min左右，3个不同剂量(75、150和300 μg/kg)的眼镜蛇毒组份60 min仅能改变曲线下面积，但对T1/2无显著影响［8］。在本实验中，酶学的第1个峰值出现在注毒后60 min，说明蛇毒在大鼠体内经快速分布扩散或渗透入机体重要靶器官，从而对心、肝等组织造成了直接的损伤。

表4 注入4 LD50蛇毒肖后不同时点相关指标的差异Table 4.4 LD50snakebite related indicators at different time points

在80 min时点，酶学曲线表现为“谷值”，大鼠多项生化指标较60 min时点有所下降，该种现象可能与毒素已基本完成在体内的快分布并已有部分被清除，此时毒素对各脏器细胞直接损伤亦较前一时点相对减少，加之机体尚有一定的自我修复能力，故在酶学上检测到的相关指标有所下降，呈现出“好转”的假象。

眼镜蛇伤大鼠在生化检测方面表现为2个峰值，而血气分析的检测则可用于区分这2个峰值;若生化检测提示心、肝功能损伤而pH正常，则提示为第1个峰值，而且处于蛇伤早期(相当于本次实验中的0－60 min时点);反之，若存在多器官功能损伤且合并血气分析检查提示代谢性酸中毒，则为第2个峰值，则为蛇伤后期(相当于本次实验中的80－120 min时点)。结合抗蛇毒血清组的结果可知，在蛇伤的早期(0－60 min时点)，及时使用抗蛇毒血清能取得很好的疗效;而在蛇伤的后期(80－120 min时点)，因蛇毒已使部分靶器官的细胞产生不可逆损伤，抗蛇毒血清的保护作用大大降低，故此时在使用抗蛇毒血清之外，治疗重点应放在防止并发症以及生命支持等治疗上，如:糖皮质激素的应用，机械通气治疗，血液净化等［11］。另外，我们提出动态观察多项指标的变化，可更科学地指导抗蛇毒血清的应用以及提高对症治疗的疗效。

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