核黄素对STZ诱导的大鼠糖尿病肾病的治疗作用

王国光，张 翠，陆晓华，李 伟

(皖南医学院病理生理教研室，安徽 芜湖 241000)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病重要的并发症之一，始于糖尿病发病之初，血糖达到糖尿病诊断标准后DN即开始[1]，是危及病人生命的主要原因。DN早期的主要病理特征是肾小球肥大，肾小球和肾小管基底膜增厚及系膜区细胞外基质的进行性积聚;后期为肾小球、肾小管间质的纤维化，最终导致蛋白尿和肾功能衰竭。DN的发病机制较复杂，目前认为高血糖、氧化应激[2，4]、糖基化末端产物[3]、高胰岛素和血脂异常等在DN的发生过程中起着非常重要的作用。越来越多的证据表明，糖尿病引起的氧化应激是导致糖尿病慢性并发症的最根本原因之一[4，5]。因此，许多具有抗氧化作用及提高机体抗氧化能力的药物被用于治疗DN[6，7]。

近年来，越来越多的研究证据表明转化生长因子－β(transforming growth factor－β，TGF－β)在 DN的发病机制中占有重要地位，TGF－β可能为DN发病机制的最后共同通路[8]，在高血糖状态下，有多种生化异常及微循环障碍共同参与DN的发生发展，包括蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的激活、蛋白非酶糖化作用、氧化应激、肾素－血管紧张素系统活性增加等，它们可通过各种途径参与TGF－β的调节，导致细胞外基质(extracellular matrix，ECM)积聚及肾小球硬化。TGF－β1引起的纤溶酶原活化抑制因子－1(plasminogen activator inhibitor－1，PAI－1)mRNA及蛋白的表达增加和纤维蛋白溶酶活性的降低，进而使ECM沉积增多。

核黄素又称维生素B，它是动物体内参与碳水化合物、蛋白质和脂肪代谢的许多酶的组成部分。并作为抗氧化维生素之一，在动物的抗氧化体系中起着重要作用[9，10]。本研究旨在探讨核黄素对链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的大鼠DN的保护作用，研究核黄素对TGF－β1和PAI－1表达的影响，初步研究核黄素对糖尿病大鼠肾脏的保护机制。

材料和方法

1 动物

雄性 Sprague－Dawley大鼠36只，体重180－220 g，购自南京青龙山动物养殖场。

2 主要试剂

STZ购自 Sigma;兔抗鼠 TGF－β1、PAI－1多克隆抗体购自武汉Boster公司;硝酸纤维素膜、碱性磷酸酶标记的Ⅱ抗、葡萄糖检测试剂盒等购自合肥博美生物公司;核黄素购自上海化学试剂采购供应站分装厂;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、考马斯亮蓝法检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

3 动物分组及模型的制备

大鼠自由饮水、进食。将大鼠随机分为3组:正常对照组(normal control，NC)、糖尿病模型组(diabetic model，DM)、核黄素治疗组(DM+riboflavin，RB)，每组10只。适应性喂养1周，禁食12 h，腹腔注射STZ 65 mg/kg(溶于0.1%pH4.5的无菌柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液)，正常对照组注射无菌柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液，48 h尾静脉空腹采血测血糖，血糖值≥13.8 mmol/L的大鼠为糖尿病模型组。造模后分组喂养，处理如下:正常对照组和模型组大鼠以正常饲料喂养，核黄素组大鼠辅以核黄素喂养，20 mg/d。各组实验大鼠于8周后，大鼠处死前1 d代谢笼收集24 h尿液，记录尿量，麻醉，颈动脉取血，分离血清，切取肾脏，用滤纸吸干后称重，一侧肾脏置－80℃冰箱保存供Western blotting检测用，部分肾脏以10%中性甲醛固定，做病理检查。

4 组织形态学观察

肾组织标本经10%中性甲醛溶液固定，常规梯度乙醇脱水，石蜡包埋，制成厚4 μm石蜡切片，行HE染色，在光镜下观察肾组织形态学改变。

5 生化指标的检测

考马斯亮蓝法测尿蛋白。取－80℃保存的各组肾皮质组织匀浆，测定SOD、CAT的活性及MDA的含量，测定血清SOD、CAT活性，测定均严格按照试剂盒说明书操作。

6 Western blotting检测

取－80℃保存的各组肾皮质组织，匀浆、离心后，标定上清液蛋白浓度上样，经12%SDS－PAGE电泳分离，将目的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，脱脂奶粉封闭，TBST冲洗后加兔抗鼠TGF－β1、PAI－1Ⅰ抗，4℃孵育过夜。TBST液冲洗，加碱性磷酸酶标记的Ⅱ抗孵育，洗膜后NBT/BCIP显色。

7 统计学处理

结 果

1 大鼠的一般状况

注射STZ诱导糖尿病后，大鼠逐渐出现多饮、多食、多尿等典型的糖尿病表现，相应的对照组大鼠食量、饮水、尿量及精神状态基本正常，体重明显增加。经喂以核黄素，大鼠的饮水、食量和尿量有较明显的改善。

2 核黄素对尿蛋白及肾脏脏器系数的影响

实验结束时，检测到糖尿病组大鼠24 h尿蛋白量明显高于正常对照组(P＜0.01)，见表1，辅以核黄素喂养的糖尿病大鼠尿蛋白量较糖尿病组明显减少(P＜0.01)，见表1。由表中1可见，糖尿病组大鼠体重下降，肾脏脏器系数增大，与正常组比较有显著差异(P＜0.01);核黄素治疗组大鼠体重及肾脏脏器系数较糖尿病组均有所改善，肾脏脏器系数明显降低(P＜0.01)。

表1 核黄素对尿蛋白及肾脏脏器系数的影响Table1.Effects of riboflavin on the content of protein in urine and the ratio of kidney and body weight(.n=10)

表1 核黄素对尿蛋白及肾脏脏器系数的影响Table1.Effects of riboflavin on the content of protein in urine and the ratio of kidney and body weight(.n=10)

##P ＜0.01 vs normal control;＊＊P ＜0.01 vs diabetic model.

Group Urinary protein(mg) Kidney weight(g) Body weight(kg) KW/BW(mg/g)Normal control 5.75 ±1.81 2.21 ±0.37 405.50 ±21.64 5.45 ±0.91 Diabetic model(DM) 39.92 ±8.57## 2.17 ±0.34 168.38 ±16.61## 13.02 ±2.40##DM+riboflavin 19.92 ±4.77＊＊ 2.06 ±0.18 281.24 ±27.05＊＊ 7.39 ±0.97＊＊

3 各组大鼠血清SOD、CAT活性变化

与正常对照组比较，糖尿病组大鼠血清的SOD、CAT活性明显降低(P＜0.01)，见图1，显示大鼠的抗自由基能力下降;而核黄素治疗组大鼠的SOD、CAT活性较糖尿病组有显著提高(P＜0.01)，见图1，表明大鼠机体的抗氧化能力有所提高。

Figure1.Effects of riboflavin on the activities of SOD and CAT in serum.NC:normal control;DM:diabetic model;RB:DM+riboflavin..n=10.##P＜0.01 vs NC;＊＊P ＜0.01 vs DM.图1 核黄素对血清SOD、CAT活性的影响

4 肾组织的抗氧化酶活性变化

糖尿病大鼠肾组织中抗氧化酶SOD、CAT活性较对照组明显降低(P＜0.01)，见表2，与此相应，MDA含量明显升高(P＜0.01)，见表2，表明组织抗氧化作用下降;核黄素组大鼠肾组织SOD、CAT活性较糖尿病组显著提高，MDA含量明显降低(P＜0.01)，见表2，显示经核黄素治疗，糖尿病大鼠肾组织抗氧化作用有所改善。

表2 核黄素对SOD、CAT活性及MDA含量的影响Table2.Effects of riboflavin on the activities of SOD，CAT，and the content of MDA in the kidney(.n=10)

表2 核黄素对SOD、CAT活性及MDA含量的影响Table2.Effects of riboflavin on the activities of SOD，CAT，and the content of MDA in the kidney(.n=10)

##P ＜0.01 vs normal control;＊＊P ＜0.01 vs diabetic model.

SOD CAT MDA Group (U/g protein) (U/g protein) (mol/g protein)Normal control 2.36 ±0.44 11.94 ±1.14 306.5 ±39.8 Diabetic model(DM)0.38 ±0.07## 3.05 ±0.55## 637.9 ±76.1##DM+riboflavin 1.24 ±0.23＊＊ 5.86 ±1.08＊＊ 441.1 ±39.5＊＊

5 Western blotting检测结果

糖尿病组和核黄素治疗组大鼠肾脏皮质都检测到TGF－β1、PAI－1蛋白的表达，核黄素治疗组大鼠肾皮质中TGF－β1和PAI－1的表达均明显低于糖尿病模型组，见图2。

Figure2.Effects of riboflavin on TGF－β1and PAI－1 in kidney.DM:diabetic model;RB:DM+ribofavin..n=6.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs DM.图2 核黄素对肾组织TGF－β1和 PAI－1的影响

6 肾组织形态学改变

糖尿病组大鼠肾小球明显充血水肿，体积增大，肾小管上皮细胞变性坏死脱落，基底膜破坏，部分结构不清。核黄素治疗组大鼠肾脏只有较轻微的充血，管腔分开，基底膜完整，结构清晰，肾小球和肾小管结构接近正常，见图3。

讨 论

DN是糖尿病中发病率较高的慢性并发症，也是终末期肾衰竭(end stage renal disease，ESRD)及糖尿病病死率增加的重要因素[11]。已成为当前医学界重点研究课题。

研究显示，DN的发生、发展与氧化应激密切相关。近年研究表明持续的高血糖引起的肾血流动力学改变、糖代谢异常伴蛋白及脂代谢异常是DN病变的基础，细胞因子被激活是DN病变的直接机制，氧化应激是它们的共同机制[4，12]。我们推测作为抗氧化维生素之一的核黄素对DN可能具有保护作用。本实验，我们以核黄素喂养糖尿病大鼠对其进行一段时间的治疗，检测大鼠24 h尿蛋白量、肾脏脏器指数均低于糖尿病大鼠，表明经治疗后的大鼠肾脏损伤减轻。本实验研究结果提示核黄素可减轻或延缓DN的发生发展，对糖尿病肾脏具有一定的保护作用。

Figure3.Kidney pathology of rats from NC，DM，RB groups(HE，×400).NC:normal control;DM:diabetic model;RB:DM+riboflavin.图3 NC、DM、RB组肾组织病理比较

在本研究，我们对大鼠血清和肾皮质组织中抗氧化酶SOD和CAT活性的检测发现，经核黄素治疗，糖尿病大鼠的抗氧化酶SOD和CAT活性有明显的提高，提示核黄素能够改善STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏的抗氧化能力，与在肾组织中检测的过氧化产物丙二醛的含量相一致。表明核黄素可能是通过提高抗氧化、抗炎能力的机制保护糖尿病大鼠肾脏。

DN在病理上主要表现为肾脏肥大、基底膜增厚及肾小球和肾小管间质细胞外基质(ECM)进行性积聚[13]，在这一过程中，TGF － β1、PAI－1 参与并发挥重要作用。TGF－β1是一种强效的致纤维化因子，是DN发展过程中的核心因子[8]。糖尿病的重要表现是高血糖，高糖可激活PKC，导致TGF－β1表达升高[8]，促使肾脏细胞发生细胞肥大、增加系膜细胞胞外基质的产生、并通过增加基质降解酶抑制物活性，抑制基质降解酶合成而减少细胞外基质的降解，从而加速DN的发生发展，造成肾脏的持续损害。

PAI－1主要由血管内皮细胞合成，可抑制纤溶酶原的活化，降低ECM的降解，促进组织ECM的积聚，加速DN的发生。研究发现高糖、TGF－β1和由糖氧化酶产生的过氧化氢能上调PAI－1 mRNA及蛋白的表达，同时显著抑制纤维蛋白溶酶活性，抗氧化剂能抑制这种作用[14，15]。PAI－1 的表达与糖尿病患者肾损害(蛋白尿)的程度呈正相关。通过基因转染技术使PAI－1基因在肾脏中定位表达，结果显示，随PAI－1表达水平增加，局部出现ECM过度积聚[11]，在肾小球纤维化区域也可检测出 PAI－1表达增高。以上表明 PAI－1是引起肾脏损伤的重要物质。另有研究证实，肾脏局部TGF－β1增加时，PAI－1的合成增加，PA的活性降低，基质中PAI－1的沉积增多。用抗TGF－β1的抗体可阻断PAI－1的增加[15]。因此，一定程度上抑制糖尿病肾脏TGF－β1、PAI－1的表达可以减轻糖尿病肾脏的损伤。

本研究Western blotting结果显示，糖尿病大鼠经核黄素治疗后，肾皮质TGF－β1蛋白及PAI－1蛋白表达明显降低，提示核黄素可能通过提高机体的抗氧化能力抑制肾组织TGF－β1、PAI－1蛋白表达，减轻糖尿病肾脏损伤。核黄素具有明显的抗氧化作用[10]，本研究也证明核黄素可提高STZ诱导的糖尿病大鼠的抗氧化能力，提示核黄素对DN的保护作用机制可能是通过提高机体的抗氧化性，抑制肾皮质TGF－β1蛋白及PAI－1蛋白表达，使肾小管间质细胞外基质减少，或降解相对增多，从而减轻或延缓DN的发生发展。

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