实验性脑出血后大鼠神经细胞凋亡与NF-κB的表达

吴 丹，滕伟禹

（中国医科大学附属第一医院神经内科，辽宁沈阳 110001）

脑出血是神经系统常见病，出血后继发性损害导致的神经细胞死亡具有重要临床意义，细胞凋亡（apoptosis）作为一种基因调控的细胞死亡方式可能为其中的一个重要环节。陈吉相等[1]研究发现，假手术组偶见凋亡细胞，表明正常脑组织一般不发生细胞凋亡；脑出血后凋亡细胞数明显增多，据此认为，细胞凋亡是脑出血周围组织损伤的一个标志，在一定程度上反映了其受损伤的程度。核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）是一种广泛存在、功能多样的核转录因子，参与多种炎症相关基因的表达和调控[2]。近年来的研究显示，NF-κB在中枢神经系统中广泛存在，可见于大脑皮质、海马和小脑突触，神经元、神经胶质细胞与血管内皮细胞中均有表达[3]。目前关于脑出血后血肿周围组织NF-κB表达的研究甚少。本实验应用立体定向技术，将自体不凝血注入大鼠尾状核制备脑出血模型，用TUNEL染色观察神经细胞凋亡，用免疫组化染色观察NF-κB的表达，并初步探讨脑出血后神经细胞凋亡与NF-κB表达的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组

健康雄性SD大鼠45只，体重250～300 g，由中国医科大学实验动物中心提供。将大鼠随机分为脑出血组和假手术组，分别按6 h、1 d、3 d、7 d分为4个亚组，每组5只；另设对照组5只。

1.1.2 试剂与器材

NF-κB/p65兔抗鼠多克隆抗体、即用型SABC免疫组化试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司；动物头颅立体定位仪（SN-2，NARISHIGHE，日本）；微量注射器（上海激光医学仪器厂）；电子分析天平（BP211D，赛多利斯，德国）；OLYMPUS光学显微镜（日本）；图像分析仪（Metamorph Image System V4.6 VIC，美国）；紫外分光光度仪（UV300，Spestronic Unicam，美国）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠脑出血模型的制作

将大鼠用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，用微量注射器从大鼠右侧股动脉抽取70 μl血。在立体定位仪引导下将50 μl血缓慢注入右侧尾状核（前囟前0.2 mm，中线右旁3.0 mm处），进针6 mm，留针10 min后退针。假手术组注入50 μl生理盐水，其他操作同实验组。对照组不给予任何处置。术后观察大鼠的行为改变，给水、给食饲养。根据实验计划在不同时间点将大鼠断头取脑。

1.2.2 标本的采集及检测

在各时间点前15 min用过量水合氯醛麻醉大鼠后，开胸经左心室插管至主动脉（0.5 min内），依次灌注生理盐水100 ml及4℃4%多聚甲醛溶液250 ml，断头取脑，固定于4%多聚甲醛溶液中持续12～24 h，然后进行酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋。

1.2.2.1 常规HE染色 切片常规脱蜡、水化，依次经苏木素染色、1%盐酸酒精分化、返蓝以及伊红染色后进行脱水、透明、封片。光镜下观察，胞质为红色，胞核为蓝色。

1.2.2.2 TUNEL染色 以TUNEL法检测凋亡细胞。切片常规脱蜡、水化，滴加脱氧核糖核酸转移酶（TDT）和地高辛标记的dUTP反应液，37℃孵育120 min；滴加生物素化抗地高辛抗体，37℃孵育30 min后DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。

1.2.2.3 NF-κB/p65免疫组化染色 用免疫组化SABC法检测NF-κB/p65蛋白的表达。切片常规脱蜡、水化后行抗原热修复，滴加 50 μl兔抗鼠多克隆 NF-κB/p65 抗体（1∶200），4℃过夜；然后滴加生物素化山羊抗兔IgG，室温20 min；滴加SABC，室温20 min。DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。

1.3 统计学处理

在400倍光镜下观察并随机选择血肿周围5个不重复视野，计算阳性细胞积分光密度。所有数据以均数±标准差（）表示，采用SPSS 13.0软件进行数据分析，采用t检验及Pearson相关分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色

脑出血后6 h可见轻度脑水肿，血肿内红细胞形态完整。1 d可见脑水肿明显，血肿周围可见中性粒细胞及淋巴细胞浸润，胶质细胞开始增生。3 d时脑水肿最重，大量炎症细胞浸润，胶质细胞增生明显，大量神经元变性坏死。7 d时血肿有所吸收，血肿周围组织疏松，胶质细胞及血管增生明显。假手术组及对照组无明显病理改变。见图1。

图1 脑出血后不同时间点HE染色（×400）

2.2 TUNEL染色

TUNEL染色阳性细胞是凋亡细胞，表现为核周染色质浓缩的点状深染棕褐色细胞。凋亡细胞在脑出血后6 h出现，1 d明显增多，3 d达到高峰，此后逐渐减少，持续到7 d，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。凋亡细胞主要分布在脑出血周围组织和同侧大脑皮层。假手术组仅见及少量凋亡细胞。见表1、图2。

表1 脑出血后不同时间点TUNEL阳性细胞表达（，积分光密度/HP）

表1 脑出血后不同时间点TUNEL阳性细胞表达（，积分光密度/HP）

与对照组比较，*P<0.05；与脑出血组6 h比较，#P<0.05

组别 时间6 h 1 d 3 d 7 d对照组（n=5）2.11±1.19---假手术组（n=5）5.12±0.736.39±2.138.48±3.738.42±1.75脑出血组（n=5）27.95±7.51*62.93±1.95*#88.59±4.91*#57.16±4.18*#

图2 脑出血后不同时间点TUNEL阳性细胞的表达（×400）

2.3 NF-κB/p65免疫组化染色

脑出血周围组织NF-κB/p65阳性细胞于术后6 h开始出现，1 d后逐渐增多，3 d达高峰，此后逐渐减少，持续到7 d仍高于对照组（P<0.05）。阳性表达部位为胞核，主要表达于神经细胞和少量胶质细胞。假手术组可见极少量阳性细胞。见表 2、图 3。

表2 脑出血后NF-κB/p65蛋白表达（，积分光密度/HP）

表2 脑出血后NF-κB/p65蛋白表达（，积分光密度/HP）

与对照组比较，*P<0.05；与脑出血组6 h比较，#P<0.05

组别 时间6 h 1 d 3 d 7 d对照组（n=5）4.29±1.96---假手术组（n=5）12.67±3.5213.64±2.5818.84±3.9618.06±3.72脑出血组（n=5）30.31±3.97*#53.17±1.32*#88.37±8.67*#42.86±1.60*#

图3 脑出血后不同时间点NF-κB/p65阳性细胞的表达（×400）

2.4 脑出血后神经细胞凋亡与NF-κB/p65表达的相关性分析

脑出血后TUNEL表达与NF-κB/p65表达呈正相关（r=0.957，P<0.01）。

3 讨论

凋亡即程序性死亡，是在中枢神经系统涉及正常发育、再生、增殖和病理变性的细胞死亡的主要方式[4]。已有研究发现，在缺血性脑组织的不同部位可见到神经细胞凋亡[5-6]。本实验结果显示，凋亡细胞在脑出血后6 h出现，3 d达高峰，7 d时仍有少量表达，提示脑出血后存在细胞凋亡且呈动态性变化，据此推断细胞凋亡是脑出血周围组织损伤的一个重要标志。

NF-κB是一种广泛存在、功能多样的核转录因子，它在免疫、炎症、细胞生长、分化、凋亡、癌变和个体发育等方面发挥着多种重要的生物学功能[7]。它由ReIA（p65）和p502个亚基以二聚体形式组成，仅p65含有激活转录的处理区[8]。已有研究证实，脑出血早期即有NF-κB表达，参与脑出血周围组织继发性损伤及脑水肿形成[9]。刘兵荣等[10]也研究发现NF-κB与脑出血后脑水肿有关。本实验结果显示，NF-κB/p65免疫组化阳性细胞于脑出血后6 h开始增多，1 d继续上升，3 d达高峰，此后逐渐下降，持续到7 d仍高于对照组，并且NF-κB与TUNEL阳性细胞的表达变化呈正相关，这与刘宗超等[11]的实验结果基本一致。大量研究证实，NF-κB具有促进中枢神经系统神经细胞凋亡的作用，在创伤、脑缺血、阿尔茨海默病及帕金森病的神经凋亡细胞内可以观察到NF-κB的激活[12-13]。由此推断，NF-κB的激活可能是导致脑出血后神经细胞凋亡的一个重要原因。

综上所述，脑出血后存在细胞凋亡，且可能与NF-κB的激活有关。进一步研究其具体机制将为脑出血的治疗提供新的思维空间。

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