蓝莓叶总黄酮提取物的定性分析和抗油脂氧化

李颖畅，孙建华，孟宪军

(1.渤海大学生物与食品科学学院，辽宁 锦州 121000；2.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110161)

油脂在氧化过程中会形成大量的自由基，进一步分解生成醛、酮、醌、游离脂肪酸等有害物质，产生酸败，从而降低其营养价值。油脂含量高的食品需添加抗氧化剂来防止脂肪氧化，目前常用的抗氧化剂均为人工合成，如BHA(丁基羟基茴香醚)、BHT(二丁基羟基甲苯)和PG(没食子酸丙酯)，实验证明人工合成抗氧化剂对人体有一定的毒副作用[1-3]，近年来上述化学合成抗氧化剂被发现有不同程度的累积致癌作用，目前BHT在美国和日本已被禁止使用，BHA在日本也已经禁用，以天然抗氧化剂取代合成抗氧化剂是食品添加剂的发展趋势。

蓝莓，又称越橘，属杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vacciniumspp.)多年生落叶或常绿灌木[4]。蓝莓作为一种药用植物，以叶入药，性温、味苦，有利尿、消炎、解毒之功效，并可用于风湿、痛风[5]。蓝莓叶中含有丰富的黄酮类化合物，大量研究证明黄酮类化合物具有抗氧化、清除自由基、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎症等广泛的生物活性[6-10]。我国有着丰富的蓝莓资源，但对蓝莓叶的加工利用极少，大部分当做废弃物，造成资源浪费和环境污染。目前蓝莓叶总黄酮的研究主要集中在提取和抗肿瘤等方面[11-12]，但作为油脂的抗氧化剂尚未见报道，研究开发高效、安全、保健的天然抗氧化剂，使其在食品工业得到广泛应用具有重要意义。本实验重点研究蓝莓叶总黄酮抗油脂和脂质体氧化能力，旨在为进一步利用蓝莓叶资源提供有益的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

蓝莓叶总黄酮提取物：将蓝莓叶(沈阳农业科技开发院蓝莓种植基地提供) 50℃烘干，粉碎后过40目筛，用体积分数80%乙醇溶液按1:20(m/V) 50℃浸提2h后抽滤，收集滤液，浓缩，石油醚脱脂，AB-8大孔树脂纯化，40℃减压浓缩，真空干燥得到黄色粉末，纯度为78.04%[13]。

猪油：新鲜猪板油熬制。

无水乙醇 北京化学试剂公司；柠檬酸、柠檬酸钠、盐酸 沈阳化学试剂厂；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫代巴比妥酸、抗坏血酸、三氯甲烷、冰乙酸、碘化钾、硫代硫酸钠、芦丁标准品(纯度大于95.5%) 国药集团化学试剂有限公司；大豆卵磷脂(生化试剂) 北京奥博星生物技术有限责任公司；BHT(食品级) 济南世纪联兴经贸有限公司；HPD-600大孔树脂 河北宝恩化工有限公司。

7200可见分光光度计 上海尤尼柯有限公司；UV-1600型紫外-可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司；PHS-25型酸度计 上海理达仪器厂；电热恒温水浴锅常州国华电器有限公司；RE-52型旋转蒸发仪 上海博通经贸有限公司；SHZ-IIIB型循环水真空泵 上海华琦科学仪器有限公司；玻璃层析柱(1cm×30cm) 上海青浦沪西仪器厂；DZF-6050型真空干燥箱 上海精宏仪器设备有限公司；电子分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；电热鼓风干燥箱 天津实验仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 蓝莓叶提取物的定性检验

氨显色反应、 铝盐反应、 铁盐反应参照文献[14]进行测定。

蓝莓叶总黄酮的紫外-可见吸收光谱：分别称取一定量芦丁标准品和蓝莓叶总黄酮，用70%乙醇溶液溶解，定容至50mL容量瓶中，加质量分数5% NaNO2溶液1mL，放置6min后，加质量分数10%硝酸铝溶液1mL，放置6min，再加质量分数4% NaOH溶液10mL，加去离子水至刻度，摇匀，放置15min，在波长400～800nm范围内进行全波长扫描。

1.2.2 蓝莓叶总黄酮抗猪油氧化性能研究

不同添加量蓝莓叶总黄酮的抗猪油氧化性能研究：准确称取一定量蓝莓叶精制总黄酮、BHT，分别加入到50g猪油中，搅拌均匀。同时以不加添加物的猪油作空白。将所有样品放置于(60±1)℃的干燥箱中，每隔一定时间搅拌一次，并交换它们在干燥箱中的位置。按照GB 5538—2005《油脂过氧化值测定方法》测定过氧化值(POV)，以POV大小表示油脂的氧化速度，POV值以每千克样品中活性氧的毫摩尔数表示，进而衡量抗氧化剂的活性。

蓝莓叶总黄酮与其他物质的协同抗氧化作用：选用抗坏血酸(VC)、柠檬酸为协同增效剂，与蓝莓叶总黄酮在猪油中进行协同抗氧化实验。

1.2.3 蓝莓叶总黄酮抗脂质过氧化能力的测定[15-16]

1.2.3.1 试液的配制

脂质体PBS(磷酸缓冲液)分散系：300mg卵磷脂溶解于30mL 10mmol/L pH7.4 PBS(磷酸缓冲液)，用超声波处理一定时间，周围以冰水冷却，制得人工脂质体。

三氯乙酸(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)-盐酸(HCl)混合液：15g TCA、0.37g TBA、2.1mL浓盐酸依次放入100mL水中。

1.2.3.2 测定步骤

分别于样品管中依次加入1mL脂质体分散系、1mL 0.4mmol/L硫酸亚铁、1mL样品，混匀。避光于37℃水浴60min，加入2mL TCA-TBA-HCl混合液，90～100℃水浴15min，迅速冷却，以3000r/min离心l0min，取上清液在波长535nm处测定吸光度(As)。对照管以1mL重蒸水代替1mL样品，操作方法同样品管，可测得对照管的吸光度(Ac)，参比管中以1mL重蒸水代替1mL卵磷脂，抗坏血酸为阳性对照。

式中：Ac为对照吸光度；As为蓝莓叶总黄酮样品吸光度。

2 结果与分析

2.1 黄酮类物质定性检验

氨显色反应：将蓝莓叶乙醇提取液滴于滤纸上风干，以挥发氨熏滤纸，立刻产生了深黄的颜色，当滤纸放置久后，因氨的挥发而褪色，这是黄酮类化合物的典型反应。

铝盐反应：向蓝莓叶乙醇提取液中加入质量分数为1%三氯化铝溶液，有一种黄色可溶性物质生成，可使溶液吸光度增大，说明有黄酮类物质存在。

铁盐反应：向蓝莓叶乙醇提取液中加入氯化铁溶液后，生成了墨绿色的沉淀， 放置一段时间之后溶液的颜色基本褪去，由此说明蓝莓叶提取物中含有酚基。酚基是黄酮类化合物的官能团之一，故判断蓝莓叶提取物属于黄酮类。

2.2 蓝莓叶总黄酮的紫外-可见吸收光谱分析

按1.2.1节加入显色剂，对蓝莓叶总黄酮和芦丁进行全波长扫描可知(图1)，蓝莓叶总黄酮和芦丁的可见吸收光谱相一致，在波长400～800nm处有吸收，最大吸收波长为500nm，由此说明蓝莓叶提取物中有芦丁，属于黄酮类物质。

图1 蓝莓叶总黄酮的吸收光谱图Fig.1 Absorption spectra of flavonoids from blueberry leaves

2.3 不同添加量蓝莓叶总黄酮对猪油的抗氧化作用

油脂暴露在空气中易氧化形成自由基，自由基的链式反应使油脂继续氧化。可以测定油脂的POV来评价其氧化程度，POV越高，氧化程度越高。由图2可以看出，蓝莓叶总黄酮对猪油有明显的抗氧化作用，随着蓝莓叶总黄酮添加量的增加，其对猪油的抗氧化作用增强，时间越长，效果越显著，添加质量分数0.4%精制总黄酮抗猪油氧化能力较强，略低于添加质量分数0.02%BHT。蓝莓叶总黄酮抗猪油氧化性原因是黄酮类化合物作为还原体，失去氢离子，提供给氧化过程中的自由基，使其形成惰性化合物，从而终止猪油的氧化。蓝莓叶总黄酮作为油脂的天然抗氧化剂是可行的，具有较好的开发应用前景。

图2 不同添加量蓝莓叶总黄酮抗猪油氧化性能Fig.2 Protecting effects of the refined folavonoid extract from blueberry leaves at different dosages against the lipid oxidation in lard

2.4 蓝莓叶总黄酮与其他物质的协同抗猪油氧化作用

图3 蓝莓叶总黄酮与抗坏血酸、柠檬酸混合使用抗氧化性能的比较Fig.3 Synergistic protecting effects between ascorbic acid or citric acid and the extract against the lipid oxidation in lard

从图3可以看出，添加质量分数0.1%蓝莓叶总黄酮分别和0.05%柠檬酸、0.05%抗坏血酸合用的抗氧化性高于0.1%蓝莓叶总黄酮的抗氧化性，低于0.02% BHT的抗氧化性。柠檬酸、抗坏血酸对蓝莓叶总黄酮有协同增效作用，并且抗坏血酸的增效作用强于柠檬酸。柠檬酸对金属离子有鳌合作用，形成金属盐，能促进氧化的微量金属离子钝化，不再具有催化能力，从而降低了油脂的氧化作用。抗坏血酸除具有一定的抗氧化作用外，还具有很强的还原性，可与油脂中的氧反应生成脱氢抗坏血酸，降低油脂中氧浓度，减缓自动氧化反应的速度；抗坏血酸的强还原性可使酚类抗氧化剂生成的酚氧自由基还原，使酚类抗氧化剂再生，抗氧化剂与抗坏血酸合用可充分地发挥其协同抗氧化作用。

2.5 蓝莓叶总黄酮抗脂质过氧化能力

图4 蓝莓叶总黄酮对脂质过氧化的抑制作用Fig.4 Inhibition effects of the crude extract from blueberry leaves and its refined counterpart against the lipid peroxidation in soybean lecithin liposomes

由图4可见，由Fe2+引发的卵磷脂脂质体体系中，蓝莓叶总黄酮对脂质体有明显的抑制作用，抑制率随总黄酮质量浓度的增加而增大。不同质量浓度蓝莓叶总黄酮对脂质体过氧化的抑制率差异显著，精制总黄酮对脂质体的抑制作用明显高于粗总黄酮。当精制总黄酮质量浓度为50μg/mL时，对脂质过氧化的抑制率为33.36%，当精制总黄酮的质量浓度为100μg/mL时，抑制率已达到83.36%，再增加精制总黄酮质量浓度时，对脂质过氧化的抑制率增长缓慢。蓝莓叶总黄酮抗脂质过氧化能力明显优于抗坏血酸(图5)。精制总黄酮的IC50为67.46 μg/mL，粗黄酮的IC50为121.65μg/mL，抗坏血酸IC50为4.74mg/mL。

图5 抗坏血酸对脂质过氧化的抑制作用Fig.5 Inhibition effect of ascorbic acid against the lipid peroxidation in soybean lecithin liposomes

3 结 论

本实验通过定性检验确定蓝莓叶提取物的主要组分是总黄酮，并通过测定猪油的过氧化值和对脂质过氧化的抑制率研究蓝莓叶总黄酮的抗油脂氧化能力。蓝莓叶总黄酮具有抗猪油氧化能力，且有剂量效应关系，0.4%精制总黄酮抗猪油抗氧化能力较强，略次于0.02%BHT。抗坏血酸、柠檬酸对蓝莓叶总黄酮均具有协同增效作用。蓝莓叶总黄酮具有抗脂质体过氧化能力，随着总黄酮溶液质量浓度逐渐增大，抑制能力逐渐增强，并且明显优于抗坏血酸。蓝莓叶精制总黄酮IC50为67.46 μg/mL，蓝莓叶粗总黄酮的IC50为121.65μg/mL，抗坏血酸IC50为4.74mg/mL。

本实验测定蓝莓叶总黄酮抗氧化效果弱于合成抗氧化剂BHT，这可能与蓝莓叶总黄酮的纯度及其含有的总黄酮种类有关，若进一步提高蓝莓叶黄酮纯度，抗氧化性能将更强。研究和开发蓝莓叶资源，使其总黄酮类物质成为合成抗氧化剂替代品，具有重要意义。

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