环氧化酶-2和 CD105在喉癌中的表达及其相关性研究

刘春秀

(济宁市医院耳鼻喉科,山东 济宁 272100)

喉癌(laryngocarcinoma)是头颈部常见恶性肿瘤之一,其致病原因迄今尚不完全明了,环氧化酶(cyclooxygenase,COX)是分解花生四烯酸(AA)、生成各种内源性前列腺素(prostaglandin,PG)过程中重要的限速酶 ,催化产生的 PG参与机体多种生理及病理过程。近年来,国内外诸多研究表明,COX-2除了在炎症中发挥重要作用外,还与多种肿瘤的发生、发展和转移有关[1]。恶性肿瘤的生长与转移依赖于新生血管的形成,COX-2与肿瘤新生血管的形成密切相关。CD105在血管内皮细胞选择性表达,作为新生血管及尚未形成血管的内皮细胞标志物,对判断肿瘤预后更具有优越性,尤其对有淋巴结转移的肿瘤更有预测价值。

本研究采用免疫组化 SP法检测喉癌组织中 COX-2及CD105的表达情况,并进一步探讨二者的相关性。为阐明喉癌的浸润、转移机制提供更多的实验资料,为喉癌的临床治疗和判断预后提供新的思路和依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料

实验组:选取的30例临床病例资料齐全的原发性喉鳞癌标本均取自住院手术切除的患者。经病理诊断为喉鳞癌。所有原发性喉鳞癌患者手术前均未进行放、化疗;其中男23例,女 7例,年龄 为 35～ 79岁 ,平均 57.8岁。病理分 级按 WHO分类标准:高分化鳞癌13例,中分化鳞癌 9例 ,低分化鳞癌 8例。其中有淋巴结转移的为16例,无淋巴结转移的为 14例(术后病理证实)。声门上型为19例,声门型为 11例,声门下型为 0例。临床分期按国际抗癌协会(UICC)1997年修订的 TNM分期标准:其中Ⅰ -Ⅱ期14例,Ⅲ -Ⅳ期16例。

对照组:10例手术切除的癌旁正常组织(距肿瘤边缘＞1.0cm),均经术后病理证实。

1.2 试剂

鼠抗人 COX-2单克隆抗体 (工作液 );鼠抗人 CD105单克隆抗体(工作液);DAB显色试剂盒,即用型 SP试剂盒。

1.3 实验方法

常规石蜡包埋;防脱片制备;HE染色;免疫组织化学染色 (SP法,微波修复 )。结果判断标准:(1)COX-2免疫组织化学染色以细胞质和(或)核膜染色出现特异性棕黄色片状或颗粒状者为阳性细胞。每张切片在高倍显微镜下(400×)随机选择5个视野,避开肿瘤边缘及坏死区域,计算每个视野COX-2阳性细胞率,取平均值作为该标本的阳性细胞率。按阳性细胞所占百分比打分:0分为 ＜10%;1分为 10%-25%;2分为＞25%-50%;3分为＞ 50%。再按阳性染色细胞与背影着色相对比打分:0分为无色、1分为淡黄色、2分为棕黄色、3分为棕褐色。将两个分值相加得出该标本的免疫组织化学的阳性分度:0-1分为阴性;＞ 1-5分为弱阳性;＞ 5分为阳性。(2)CD105免疫组织化学染色阳性为血管内皮细胞染成棕黄色,其中以细胞膜着色较深。微血管判断标准及计数方法:在肿瘤区内单个或成丛的内皮细胞,不管成腔与否均视为单个血管,凡管腔面积＞8个红细胞直径,带有较厚肌层的血管及硬化区域的血管均不计数,不论肿瘤实质区还是间质区均为测量对象。先在低倍镜下(10× )选取肿瘤微血管数量最丰富区,在高倍显微镜下(400×)计算5个视野范围微血管数目,然后取平均值,作为 MV D。

1.4 统计学处理

全部资料采用 SPSS10.0软件包进行统计分析。

2 结果

2.1 COX-2、 CD105的表达及定位情况

COX-2阳性染色主要位于癌细胞的胞质,而且血管内皮细胞的胞质也有部分着色。棕黄色颗粒弥漫分布于整个胞质或沿核膜周边呈线状分布。COX-2在喉癌组织中的阳性部位主要位于癌细胞浸润灶、喉癌角化珠和坏死灶周围。COX-2在喉癌组织和正常组织中均有表达,差异有统计学意义 (P ＜ 0.05)。

CD105阳性染色(棕黄色)主要位于微血管内皮细胞的细胞膜和细胞质,微血管主要见于癌间质。并且在癌巢边缘的 MV D强于中央,但大血管内皮细胞细胞膜和细胞质中未见表达,CD105在喉癌组织和正常组织中均有表达,差异有统计学意义 (P＜0.05)。

2.2 COX-2在喉癌组织中的表达与临床病理特征的关系

见表1。

表1 喉癌组织中 COX-2表达与临床病理参数关系

经 Fisher确切概率法统计分析,COX-2在喉癌中的表达与患者病理分级无关((均 P＞ 0.05);与临床分期有关,Ⅲ -Ⅳ期病例 COX-2阳性表达率高于Ⅰ -Ⅱ期病例,二者差别有统计学意义 (P＜0.05);与淋巴结转移有关,有淋巴结转移组 COX-2阳性表达率高于无淋巴结转移组,二者差别有统计学意义 (P＜0.05)。

2.3 喉癌组织与癌旁正常组织中 COX-2表达及 MV D的关系

喉癌组织中 COX-2阳性表达率为70.00%,癌旁正常组织中 COX-2阳性表达率为 20.00%,两组相比较,差异有统计学意义 (P ＜0.05)。通过 MVD计数发现,30例喉癌组织的平均 MVD为(8.63±1.85)条 /HP;癌旁正常组织的平均MVD为(3.16± 1.02)条 /HP,两组相比较,差异有统计学意义 (P ＜ 0.05)。见表2。

表2 喉癌、癌旁组织中 COX-2表达及 MVD

2.4 COX-2在喉癌中的表达与 MVD的关系

根据 COX-2的表达情况,将样本分为3组。经统计学分析:阴性与弱阳性比,差异有统计学意义 (P ＜0.05);阴性与阳性比,差异有统计学意义 (P＜0.05);弱阳性与阳性比,差异有统计学意义 (P ＜0.05)。表明 COX-2的表达与MVD之间具有相关性。见表3。

表3 喉癌组织中 COX-2表达与 MV D的关系

2.5 喉癌组织中 MVD与淋巴结转移的关系

经统计学分析:有淋巴结转移组 MVD值高于无淋巴结转移组,二者间差异有统计学意义 (P ＜0.05)。表明 CD105标记的 MV D与淋巴结转移之间具有相关性。见表4。

表4 喉癌组织中 MVD与淋巴结转移的关系

3 讨论

喉癌的发生一般认为与烟酒过度及环境污染等因素引起的长期炎性刺激有关,而慢性肥厚性喉炎被认为是喉癌的癌前病变之一。提示参与炎症过程的一些因素与喉癌的发生、发展可能有关。环氧化酶是分解花生四烯酸、生成各种内源性前列腺素过程中重要的限速酶,前列腺素作为重要的炎症介质,具有促进细胞增生和抑制细胞凋亡以及刺激新生血管生成等多种功能。哺乳动物至少有两种同工酶:COX-1和COX-2;都是完整的膜结合蛋白,COX-1是结构型表达蛋白,被认为是“看家基因”,在大多数组织细胞中持续低浓度表达,参与维持正常的生理功能,如保护胃黏膜,肾脏血流的调节和控制血小板聚集、稳定内环境等;COX-2是一种可诱导型蛋白,被认为是“快速反应基因”,在正常生理状态下多数组织内检测不到,但在细胞受到相应刺激后迅速合成,研究表明,在接受刺激后 COX-2的表达在24h内可以有数十倍的增加,参与多种生理及病理过程,COX-2的表达首先在炎症性疾病过程中被发现。但近几年来,国外诸多研究表明COX-2参与了肿瘤的发生和发展,其中尤其是 COX-2与肿瘤新生血管的形成密切相关。肿瘤的生长和转移依赖于新生血管的形成,新生血管不仅为肿瘤生长提供必须的营养成分,同时为肿瘤细胞进入循环系统导致远处转移提供通道,亦可分泌一些细胞因子促进肿瘤细胞的增殖。

研究发现 COX-2在结肠癌、直肠癌、前列腺癌、膀胱癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌等中有较高表达,并认为参与了肿瘤的发生和发展。但 COX-2与喉癌关系的研究较少。本研究应用免疫组化 SP法检测喉癌和癌旁正常组织中 COX-2表达,发现喉癌组织中 COX-2表达阳性率70%高于癌旁正常组织中 COX-2表达阳性率20%,两者比较差异具有统计学意义 (P＜0.05)。同时发现 COX-2的表达位于癌细胞的细胞质中,表明 COX-2主要由癌细胞表达产生,与喉癌的发生和发展关系密切。

Murata等[7]以蛋白印迹法、标准密度扫描技术半定量测定15例胃癌及非癌组织 COX-2的表达情况。结果表明,胃癌COX-2的表达明显增加,且增高程度与周围淋巴结转移情况和胃癌的 TNM分期有关。但有人在宫颈癌的研究中发现COX-2的过度表达与宫颈癌的临床分期无关[11]。本研究发现Ⅲ -Ⅳ期喉癌组织 COX-2阳性表达率高于Ⅰ -Ⅱ期 ,二者比较差别有统计学意义 (P＜0.05)。有淋巴结转移组COX-2阳性表达率高于无淋巴结转移组,二者比较差别有统计学意义 (P＜0.05)。提示较晚期的喉癌产生较多的COX-2以维持肿瘤的生长,COX-2的过度表达与喉癌的浸润和转移有关。本研究还表明 COX-2的表达与喉癌病理分级无相关性 (均P＞ 0.05),提示 COX-2并不参与喉癌的组织分化,与肿瘤的恶性程度无关。该结果与蒋代华等[12]在鼻咽癌中的研究结果一致。研究表明,COX-2可能在肿瘤的发生、发展等多个环节发挥作用[1～3]:①促进肿瘤细胞的增殖和生长;②抑制肿瘤细胞的凋亡;③参与肿瘤血管形成;④促进肿瘤细胞的浸润;⑤降低放、化疗的细胞毒性;⑥增强促癌物质的致癌作用。当实体肿瘤大小超过 1～ 2mm3时就需要持续不断的新生血管生成。肿瘤新生血管的形成能力常用微血管密度(MV D)表示。肿瘤组织的 MVD与癌症患者的预后直接相关,关于喉癌的 MVD是否与预后相关有相互矛盾的研究报道,还存在不少争议,这可能与血管内皮细胞标记物的不同有关。采用Ⅷ因子、CD31、CD34等泛血管内皮细胞标志物对肿瘤组织中血管内皮细胞进行免疫组织化学染色,来评价肿瘤组织中 MV D已为多数学者所应用。CD105是一种同型二聚体的膜结合性糖蛋白,是内皮细胞表面与增殖相关的膜抗原,在血管内皮细胞选择性表达,主要表达于新生血管及尚未形成血管的内皮细胞,是新生血管的标志,推测CD105对肿瘤的微血管计数比普通的泛血管内皮标记物更敏感,更适应于肿瘤组织。

Kumar等[8]用 CD34检测乳腺癌所得的 MVD只与肿瘤大小有关;而由 CD105检测所得的 MVD却可以成为乳腺癌病人预后的独立性指标,能定量区别肿瘤新生血管和已存在血管。进一步观察发现,同一部位正常血管 CD34染色阳性,而相同部位的新生血管 CD105染色阳性,CD34却不着色。Akagi[10]同样采用抗— CD34mAb及抗— CD105mAb对大肠癌的新生血管进行标记,结果发现 CD34仅能使部分血管染色,没有统计学意义;而 CD105可以作为大肠癌新生血管有价值的标志物。血管内皮的高度异质性决定了正常血管内皮标记物并不适应于肿瘤组织,肿瘤生长所引起的并不仅仅是血管数目的增加,还可能包括表达在血管上的多种蛋白分子的改变。理想的肿瘤新生血管评价指标,不仅要包括数目的改变,更要含有质量的改变,只有这样才能提高检测的敏感度和可信度。通过比较,可以认为 CD105是较 CD31、CD34和Ⅷ因子等泛血管内皮细胞标记物为好的一种肿瘤血管内皮标志物。

本研究用 CD105标记 MVD计数发现,30例喉癌组织的平均 MVD为(8.63±1.85)条 /HP,10例癌旁正常组织的平均 MVD为 (3.16± 1.02)条 /HP,两组比较差异有统计学意义 (P ＜0.05),表明 CD105标记的 MVD与喉癌的关系密切。Brewer等[9]对 CD105标记头颈部癌新生血管的表达进一步研究,以Ⅷ因子相关性抗原作对比,结果发现 CD105的微血管计数与淋巴结转移有关,而Ⅷ因子的微血管计数与淋巴结转移无关,本研究检测有淋巴结转移组平均 MV D为(11.08±1.98)条/HP,无淋巴结转移组平均 MV D为(5.87±1.28)条/HP,两组比较差异有统计学意义(P ＜0.05)。该结果与以上研究结果一致。提示 CD105标记的 MV D与喉癌患者淋巴结的转移密切相关,可能成为判断喉癌患者预后的一个独立指标。

COX-2的表达水平与肿瘤组织中的 MVD具有相关性。本研究发现,随着喉癌组织中 COX-2表达的升高,CD105标记的 MV D也逐渐升高,每两组比较差异有统计学意义。提示 COX-2过度表达可刺激喉癌组织的新生血管形成。COX-2在肿瘤组织中促进血管形成的机理尚未完全明确,基本可概括为:(1)诱导肿瘤细胞及单核巨噬细胞等产生VEGF[4];(2)肿瘤组织中产生的 PGE2、PGF2及 TX A2等直接或间接促进血管生成;(3)抑制内皮细胞凋亡,促进血管生成;(4)缺氧诱导 COX-2促进肿瘤血管的生成[6];(5)一氧化氮合酶(NOS)又诱导 COX-2促进肿瘤血管的生成[5];(6)激活基质金属蛋白酶(MM P)和整合素(IF)促进肿瘤血管的生成[5]。

本研究表明 COX-2在喉癌中高表达,并与肿瘤的新生血管生成密切相关。CD105标记的 MVD与喉癌的淋巴结转移关系密切,可能成为判断喉癌患者预后的一个独立指标。

本研究提示应用特异性 COX-2抑制剂可以抑制喉癌中新生血管形成,为喉癌患者特别是晚期患者的治疗提供新途径,提高喉癌患者的生存率。CD105主要表达于新生血管,提示 CD105标记的微血管密度可为喉癌的放疗敏感性提供指标。推测 COX-2抑制剂与放疗联合应用或许可以取代手术治疗,保留喉癌患者的喉功能。

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