张亚丽,董琳,陈小芳,周晓聪,李锦燕,李孟荣
(温州医学院附属育英儿童医院 呼吸科,浙江 温州 325027)
呼吸道合胞病毒(RSV)是婴幼儿下呼吸道感染最常见的病原,研究显示,RSV感染的气道上皮细胞能产生调节激活正常T细胞表达、分泌的细胞因子(RANTES)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)等趋化因子,从而引发过度的气道炎症反应[1-2]。RSV感染患儿鼻腔盥洗液及鼻咽分泌物RANTES水平明显增高,且与疾病严重程度相关[3-4],有低氧表现的RSV毛细支气管炎患儿鼻炎分泌物中MCP-1水平明显升高[5],提示趋化因子可能在RSV感染发病中发挥重要作用。几乎所有儿童2岁时均感染RSV,但仅1%~2%需住院治疗,造成病情差异的原因尚不清楚,许多严重RSV感染患儿并不存在早产、先天性心脏病、支气管肺发育不良等高危因素,因此,宿主的遗传因素与RSV感染发病的关系正成为研究的焦点。既往研究已证实调控RANTES和MCP-1的基因位点存在多态性[6-7]。本研究通过病例-对照分析,探讨RANTES-403G/A、MCP-1-2518A/G的单核苷酸多态性(SNPs)与RSV毛细支气管炎易感性的相关性,筛选与疾病易感性相关的SNP位点。
1.1 对象 病例组为2006年11月-2007年3月入住温州医学院附属育英儿童医院呼吸科,诊断为RSV毛细支气管炎患儿150例,其中男111例,女39例,年龄1~24个月,有早产、双胎、先天性心脏病、支气管肺发育不良、免疫缺陷等基础疾病者除外。对照组选择同期健康体检的儿童120例,男92例,女28例,年龄2~24个月。两组均无特应性疾病史及家族特应性疾病史,均为汉族,无血缘关系。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA提取:用Chelex-100快速提取法提取基因组DNA。
1.2.2 聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性技术(PCR-RFLP)检测:各位点信息、引物、产物长度、PCR反应条件及限制性内切酶见表1。PCR反应体系为20μL:Primer F(10μmol/L)1μL,Primer R(10μmol/L)1μL,dNTPMix(2 mmol/L)2μL,MgCl2(25 mmol/L)1.6μL,10×Buffer 2μL,DNA模板2μL,Taq DNA聚合酶(1U/μL)1.5μL,去离子水8.9μL。取PCR产物5μL,限制性内切酶3 U,10×Buffer 1μL,余用去离子水补齐,总体积为10μL,37 ℃水浴箱中酶切过夜。30 g/L琼脂糖凝胶鉴定基因型(见图1、图2)。
表1 各位点的基本信息、引物、反应条件、产物产度及限制性内切酶
图1 RANTES-403G/A位点PCR-RFLP电泳图谱
图2 MCP-1-2518G/A位点PCR-RFLP电泳图谱
1.3 统计学处理方法 基因型与等位基因频率Hardy-Weinburg平衡吻合程度用x2检验;基因型及等位基因频率的比较用x2检验;用Logistic回归模型判断等位基因型对发病危险度的影响。
2.1 RANTES-403G/A基因型及等位基因分布 病例组和对照组均可见GG、GA、AA 3种基因型,以GA杂合子基因型为主;经Hardy-Weinberg平衡检验,对照组的遗传平衡,表明该群体来自同一孟德尔群体(x2=0.052,P>0.05);而病例组的遗传不平衡(x2=10.894,P<0.05)。两组基因型频率差异有显著性(x2=10.024,P<0.05);病例组A等位基因的频率明显高于对照组(x2=3.912,P<0.05)(见表2);与G等位基因携带者相比,A等位基因携带者患RSV毛细支气管炎的风险明显增加 (OR=1.415,95%CI:1.003~1.996,P<0.05)。2.2 MCP-1-2518A/G基因型及等位基因分布 病例组和对照组均可见GG、GA、AA 3种基因型,以GA杂合子基因型为主;经Hardy-Weinberg平衡检验,对照组的遗传平衡(x2=0.468,P>0.05);而病例组的遗传不平衡(x2=8.153,P<0.05)。两组基因型和等位基因型频率差异均无显著性(见表 3)。
表2 RANTES-403G/A基因型及等位基因分布
RANTES基因位于人染色体17q11.2-q12,该区域与哮喘等特应性疾病基因连锁,目前,RANTES基因启动子区研究最多的3个多态性位点分别为-403G/A、-109T/C、-28C/G。其中-403位点G/A的变异,可能对其基因转录造成影响,从而影响疾病的发生发展。Fryer等[8]发现白人哮喘和特应性个体-403A等位基因频率高于正常个体,推断-403A与哮喘易感性和特应性有关。文惯宇等[9]也报道-403A可能是特应性体质的易感因素,但未发现RANTES-403G/A位点基因多态性与RSV毛细支气管炎的相关性。Amanatidou等[10]的研究则发现,RANTES基因-28C/G、-403G/A和Aln1.1T/C位点与RSV毛细支气管炎的易感性均无关,但基因型同时为-28C/C、-403G/A和Aln1.1T/T的个体易患该病。本研究结果显示温州地区RSV毛细支气管炎患儿和正常儿童均存在GG、GA和AA 3种基因型,两组基因型频率差异有显著性,RSV毛细支气管炎组RANTES-403A等位基因频率高于对照组,与携带G等位基因个体相比,携带A等位基因的个体患毛细支气管炎风险增加了1.415倍,提示RANTES-403A等位基因与RSV毛细支气管炎易感性相关,可能是影响RSV毛细支气管炎发病的一个重要候选基因。
MCP-1编码基因位于人染色体17q11.2,由3个外显子和2个内含子组成,该段基因亦与哮喘等特应性疾病基因连锁。目前,MCP-1启动子区研究最多的两个多态性位点为-2518G/A和-2076A/T。Rovin等[7]报道MCP-1-2518位点基因多态性影响MCP-1的转录及表达水平,MCP-1-2518G等位基因能使MCP-1转录增多,从而使其蛋白表达水平上调。Szalai等[11]发现MCP-1-2518G等位基因可增加婴幼儿哮喘的易感性,并与病情相关。目前国内外尚无MCP-1-2518G/A基因多态性与RSV感染发病的报道,本研究未发现MCP-1-2518G/A基因多态性与RSV毛细支气管炎易感性之间存在关联。
综上所述,本研究结果提示RANTES-403A可能是影响RSV毛细支气管炎发病的一个重要候选基因,尽管未发现MCP-1-2518G/A基因多态性与RSV毛细支气管炎易感性之间存在关联,但RANTES和MCP-1位于同一染色体的同一区段,两位点所形成的单体型与RSV毛细支气管炎易感性是否相关,有待进一步探讨。另外,RANTES基因多态性只能部分解释RSV毛细支气管炎的易感性,本课题组其他研究发现TNF-α-308A等位基因、IL-8-251A与781C等位基因形成的AC单体型均与RSV毛细支气管炎的易感性相关,这些易感基因相互之间是否存在联合或协同作用,目前尚不明了,有待今后进一步研究。
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