生态养猪发酵床菌种产蛋白酶特性的研究

尹红梅，张国民，郭照辉，谭周进，贺月林

（1.湖南省微生物研究所，湖南 长沙410005；2.湖南农业大学，湖南 长沙410128；3.湖南中医药大学，湖南 长沙410208）

发酵床养猪是利用全新的自然农业理念，结合现代微生物发酵处理技术而提出的一种环保、安全、有效的生态养猪法，它实现了养猪无排放、无污染、无臭气、并彻底解决了规模养猪场的环境污染问题。猪粪中含有丰富的有机质，其中蛋白质的含量又比较高，因而向发酵床接种产蛋白酶高的发酵床菌种，能有效地促进有机物降解，加速猪粪腐熟进程，同时还有利于消除致臭物质，减轻对环境的污染[1]。所以筛选产蛋白酶高的发酵床菌种，并对其产蛋白酶特性进行研究具有很大的实际意义。笔者采用福林法对6种不同的芽孢杆菌进行产蛋白酶活力测定，并对其产蛋白酶活力高的菌株进行培养基优化，旨在研究高产蛋白酶菌种的产酶特性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 培养基 （1）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，琼脂 15～20 g，水 1 L，pH 7.2。（2）发酵培养基：葡萄糖0.5%，淀粉0.3%，豆饼粉1.5%，硫酸锰0.006 2%，磷酸二氢钾0.4%，硫酸镁0.05%，酵母粉1%，蛋白胨0.5%，氯化铁0.01%，CaCO30.1%，水 1.0 L，pH 7.2。

1.1.2 菌 种 供试菌种为武汉芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，7号芽孢杆菌，9号芽孢杆菌，Y2芽孢杆菌，BB1芽孢杆菌，菌种均由课题组保存。

1.1.3 试 剂 供试试剂为福林试剂[2]，磷酸盐缓冲液（pH 7.2），2%酪蛋白溶液，0.4 mol/L三氯乙酸，0.4 mol/L碳酸钠。

微量元素试剂[3]：FeSO40.5 g，NaCl 0.5 g，Na2MoO4·2H2O 0.5 g，CuCl20.1 g，ZnSO40.5 g，H3BO30.5 g，MnSO41.0 g，去离子水 1.0 L。

1.1.4 仪 器 供试仪器有离心机，UV-1 600紫外分光光度计，水浴锅，冷凝回流装置，分析天平。

1.2 方法

1.2.1 福林法测定蛋白酶活力 （1）绘制标准曲线：配置不同浓度的酪氨酸溶液，用紫外分光光度计测得不同浓度酪氨酸溶液的吸光度，绘制酪氨酸浓度与吸光度的标准曲线，方法参照文献[2]。（2）蛋白酶活力的测定：对6个样品菌种进行发酵培养，在120 r/min摇床中，30℃下分别培养24 h和48 h。再各取发酵培养液5 mL进行离心，2 000 r/min离心20 min，取上清粗酶液。取6支试管，分别编号，每支试管加入相应酶液1 mL，置于40℃水浴预热2 min，再分别加入同样经预热的酪蛋白1 mL，精确保温10 min。再分别加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL，以终止反应，继续置于水浴中保温20 min，残余蛋白质沉淀后离心。另取6支试管，分别编号，每支试管内加入离心上清液1 mL，再加0.4 mol/L碳酸钠5 mL，已稀释的福林试剂1 mL，摇匀。40℃保温发色20 min后进行吸光度测定，每组测3次，取平均值。每支试管各设一个空白试验，即在加酪蛋白之前先加0.4 mol/L三氯乙酸2 mL，使酶失活，再加入酪蛋白，测定方法同上。（3）蛋白酶活计算：以在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸，定义为一个蛋白酶活力单位。蛋白酶活力计算公式为：

A：由样品测得OD值，查标准曲线得相应的酪氨酸微克数；4：4毫升反应液取出1mL测定；N：酶液稀释倍数；10：反应10 min。

1.2.2 高产蛋白酶菌种培养基优化 对于产蛋白酶效果好的菌种，在其培养基中加入微量元素，使微量元素溶液在发酵培养基中的浓度为0.4%，然后同样用上述方法测定蛋白酶活力，并比较加入微量元素前后菌种产蛋白酶活力大小的变化。

2 结果与分析

2.1 不同菌种产蛋白酶活力随时间的变化

不同芽孢杆菌产蛋白酶活力随时间的变化见表1。由表1可以看出：7号芽孢杆菌、9号芽孢杆菌和Y2芽孢杆菌产蛋白酶的活力很小，发酵24 h后分别为256 U、438 U和248 U，而武汉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和BB1芽孢杆菌产蛋白酶的活力相对较大，发酵24 h后分别为2 567 U、601 U和1 630 U。同时，发酵48 h之后测定菌种的蛋白酶活力比发酵24 h的大，以枯草芽孢杆菌表现更突出。

表1 不同芽孢杆菌发酵24、48 h的蛋白酶活力

2.2 微量元素对菌种产酶的影响

微量元素对三种高产蛋白酶的芽孢杆菌的影响见表2，从表2可以看出，在加入微量元素后，武汉芽孢杆菌的产蛋白酶的活力明显增大，发酵24 h后测定的蛋白酶活力由原来的499 U增大到4 081 U，而发酵48 h后测定的蛋白酶活力则由原来的5 456 U增大到6 808 U。而微量元素的加入对其他2个菌种产蛋白酶的活力并没有明显的影响。

表2 微量元素对芽孢杆菌产酶的影响（发酵24、28 h）

3 分析与讨论

芽孢杆菌是一类具有内生芽孢，繁殖能力强，且在自然界中广泛存在的非致病细菌。近年来国内外对于芽孢杆菌产抗真菌活性物质的研究比较多，但是对于其产蛋白酶的研究相对较少[4-5]。

采用福林法对6种芽孢杆菌进行发酵后产蛋白酶活力测定。实验结果表明，6种芽孢杆菌均有产蛋白酶能力，且在发酵48 h后蛋白酶的产量都比发酵24 h后的要多。其中，武汉芽孢杆菌具有最高的产蛋白酶能力，枯草芽孢杆菌和BB1的产量其次，另外的Y2、7号、9号菌种的产蛋白酶量很小，不具有实际的生产意义，所以在优化实验中没有进行测定。第2次在发酵培养基中加入微量元素溶液后，武汉芽孢杆菌的产蛋白酶量明显增大，且在发酵24 h内蛋白酶活力增加更为明显，推测是Zn2+、Cu2+、Fe2+、Mn2+等金属离子的加入，可以作为武汉芽孢杆菌某些蛋白酶的辅基，从而促进了某些蛋白酶的合成。而枯草芽孢杆菌和BB1芽孢杆菌的产蛋白酶量没有很大的变化，即微量元素对其产蛋白酶没有促进作用。所以，在实际生产中可以对武汉芽孢杆菌的产蛋白酶进行微量元素的优化。

[1] 谢金防，熊文华，刘林秀，等.对发酵床养猪技术的认识与思考[J].猪业科学，2008，（9）：46-47.

[2] 陆文清，李德发，任继平.福林显色法测定饲料用蛋白酶活力的要点分析[J].饲料研究，2003，（9）：29-30.

[3] 郭成栓，谢 和.枯草芽孢杆菌B1⑥菌株产蛋白酶液体发酵条件优化[J].山地生物学报，2006，25（6）：554-557.

[4] 权春善，王军华，徐洪涛，等.一株抗真菌解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其发酵条件的初步研究 [J].微生物学报，2006，46（1）：7-12.

[5] Kim P I,Chung K C.Production of an antifungal protein for control of Colletotrichttm lagemtrium by Bacillus amyloliquefacicns MET0908.FEMS[J].Microbiology letters,2004，234 （1）：l77-183.