气-质联用(GC/MS)法测定烟草生物碱的方法优化

肖遂，周冀衡，杨虹琦，彭艳，柳立，尹光庭

(湖南农业大学 烟草科学与健康重点实验室，湖南 长沙 410128)

烟草生物碱是评价烟草及其制品感官质量的重要指标[1].目前，中国对烟叶生物碱的组成含量研究还不系统，主要是由于其中的微量生物碱含量极低，运用常规方法无法准确检测，使用气相色谱-质谱联用(GC/MS)法是解决这一问题的有效方法，该技术在烟草生物碱的分析测定中的应用已有相关报道[2-5].但目前已有的方法在提取分离的相关技术参数上并无系统研究，存在不能确保烟叶生物碱各个组分完全提取和对含量极低的麦斯明检测效果不理想等问题，需要优化提取分离技术和测定方法的相关技术参数，建立起准确、快捷、可靠的检测方法.笔者对气-质联用(GC/MS)法测定烟草生物碱的方法进行了优化，现将结果报道如下.

1 材料与方法

1.1 材 料

供试烟叶为云南省大理弥渡样品.

美国Aglent公司6850-5975C气相色谱-质谱联用仪，配自动进样器；意大利Finnigan公司Trace GC ultra气相色谱仪，配自动进样器；MS条件：电离方式为电子轰击(EI)，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，连接管温度280 ℃，溶剂延迟3 min，采用全扫描方式(Scan)；升温程序：初温90 ℃，以15 ℃/min升至140℃，保持20 min，再以15 ℃/min升至260 ℃，保持5 min.GC条件：DB-5MS色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度250 ℃；氢火焰离子检测器温度280℃.载气为高纯氮(纯度＞99.999%)，流速2.0 mL/min；不分流进样.升温程序同上.

郑州长城科工贸有限公司R201D-II旋转蒸发仪，KQ-100DE型数控超声波(昆山市超声仪器有限公司).

NaOH、CH2Cl2、无水硫酸钠均为分析纯试剂(国药集团化学试剂有限公司)；烟碱、降烟碱、麦斯明、假木贼碱等标样均购于美国SIGMA公司，纯度＞98%.

1.2 方 法

1.2.1 生物碱提取分离技术的优化

(1)提取方法的正交优化[6-7].样品提取分离过程中NaOH溶液的浓度(A)、NaOH溶液的用量(B)、浸泡时间(C)和超声时间(D)是影响被分析物是否被提取完全的主要因素.采用正交试验L9(34)(表1)法，准确称取0.5 g样品置于100 mL带塞三角瓶中，加10 µL喹啉(5 mg/mL)内标，按表1加入NaOH溶液，浸泡一定时间后超声，超声后离心取上清液，用CH2Cl2萃取3次，合并有机层，加少量无水硫酸钠，放置冰箱中冷藏过夜，用旋转蒸发仪于 45 ℃水浴中将萃取液浓缩至1 mL，进行GC分析，记录选定的烟碱、降烟碱、麦斯明、假木贼碱和新烟草碱 5个组分的峰面积之和.正交试验结果采用 DPS V2.00统计软件进行分析.

(2)萃取溶剂体积的确定.在其他前处理条件不变的情况下，考察不同萃取溶剂体积(10、15、20、25、30 mL(萃取 3次))对萃取量的影响，进行 GC分析，记录选定的烟碱、降烟碱、麦斯明、假木贼碱和新烟草碱5个组分的峰面积之和.

1.2.2 GC-MS测定烟叶生物碱含量

(1)生物碱的定性与定量.采用 GC-EI/MS全扫描方式(Scan)对烟草生物碱进行定性.内标法相对定量，由于新烟草碱无标样，利用保留时间与之相近的假木贼碱响应因子定量.

(2)线性回归方程及检测限的确定.准确量取烟碱24.75 µL溶于1 mL二氯甲烷，配成25 mg/mL的烟碱标准液；准确称取降烟碱25 mg溶于1 mL二氯甲烷，再量取80 µL溶于1 mL二氯甲烷，配成2 mg/mL的降烟碱标准储备液；分别准确称取麦斯明、假木贼碱各25 mg溶于1 mL二氯甲烷，再各量取40 µL溶于1 mL二氯甲烷，配成1 mg/mL的麦斯明和假木贼碱标准储备液.分别准确移取上述烟碱、降烟碱、麦斯明和假木贼碱的标准储备液80、500、40、200 µL，再定容至1 mL，配成混标母液.取混标母液 300、200、100、80、60、40、20、10 µL，各加入10 µL喹啉(5 mg/mL)内标，再定容至1 mL，制备成系列标准溶液.按色谱条件测定，以分析物峰面积和内标峰面积的比(Y)对相应的质量浓度(X)(μg/mL)进行线性回归；将逐级稀释的标准溶液分别进样1 µL，以3倍基线噪声作为检出限.

(3)回收率及重现性试验.将烟碱、降烟碱、麦斯明和假木贼碱的标样分别配制成高、中、低3个浓度添加到样品中，样品生物碱含量及添加标样量见表4.每个添加浓度重复5次，计算各生物碱的平均回收率和相对标准偏差，以分别考察方法的准确度和精密度.1.2.3 样品测定

取已知烟碱含量(常规方法检测[8])的样品5份，烟碱含量为1.80%～4.05%，其含量范围符合优质烤烟烟碱含量标准，每份样品测定3次，记录样品中不同生物碱组分峰面积的RSD.

2 结果与分析

2.1 生物碱提取的最佳条件

正交试验结果(表1)表明，各因素对试验结果影响的强弱次序为B、C、A、D，较优的水平组合为A4B2C3D3，即用2 mol/L的NaOH溶液40 mL，浸泡样品3 h后再超声提取1 h，得到样品各组分的峰面积之和最大.

不同的萃取溶剂体积对萃取量的影响结果表明，当萃取溶剂体积由10 mL增加到20 mL时，各生物碱组分峰面积之和随着萃取溶剂体积的增加而大幅增加，而由20 mL增加到30 mL时各生物碱组分峰面积之和略有下降，这可能是由于萃取溶剂体积过大导致浓缩步骤对目标成分造成少量损失.为确保各个组分提取完全，选取20 mL作为最佳的萃取溶剂体积.

表1 正交试验结果Table 1 Results of the orthogonal test

2.2 定性定量结果及检出限

经GC-MS分析鉴定，各生物碱的保留时间及匹配度见表2，得到标准样品总离子流图(图1)和样品总离子流图(图2).线性回归方程、相关系数及检出限见表 2.结果表明：各生物碱呈现较好峰型，无重叠无拖尾，匹配度均达到定性要求，且当烟碱、降烟碱、麦斯明和假木贼碱的质量浓度分别为20～600、30～300、3.2～12.0、16～60 mg/L 时，呈现良好的线性关系.

表2 各生物碱的定性定量分析结果Table 2 Qualitative and quantitative investigation of alkaloids

图1 生物碱混合标准液总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of standard samples

图2 样品生物碱总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatogram of tobacco sample

2.3 回收率和重现性

回收率和重现性试验结果(表3)表明，各生物碱质量浓度在5.1～14 650 µg/mL时，加标回收率为88.5%～105.4%，RSD为2.4%～9.2%，说明本方法的重复性较好，准确度和精密度均符合分析要求.

表3 方法的添标回收率和精密度(n=5)Table 3 Recovery and precision of the method (n=5)

2.4 样品的测定结果

由表4可知，5份样品的烟碱占总生物碱含量平均为95.4%.微量生物碱的含量从大到小依次为新烟草碱、降烟碱、假木贼碱、麦斯明，其检测的含量范围和各组分含量所占比例与已有报道[9-11]基本一致.另外，同一样品的 3次测定结果在不同组分的峰面积的RSD平均值小于9.6%，说明该方法能有效地应用于生物碱含量差异明显的烟叶样品检测.

表4 烟叶样品生物碱含量测定Table 4 The alkaloids content of flμe-cμred tobacco samples n=3

3 结 论

通过试验对影响超声提取和有机溶剂萃取的几个关键因素的参数进行了优化，得到的优化条件是：用2 mol/L的NaOH溶液40 mL，浸泡样品3 h后超声提取1 h，再分别用20 mL二氯甲烷萃取3次，浓缩至1 mL进GC-MS分离鉴定.样品添加标样回收率测定的不同组分峰面积 RSD平均值小于9.2%，说明所建立方法的重现性较好.应用优化的分析技术对烟碱含量为 1.80%～4.05%的 5份样品进行生物碱组成和含量分析，证明该技术可较好地检测出生物碱含量差异明显的烟叶样品中的烟碱、降烟碱、麦斯明、假木贼碱和新烟草碱，RSD平均值小于9.6%.该方法具有检测烟草生物碱灵敏度高和重现性好的特点，且操作简便，能确保烟叶生物碱各个组分提取完全，可有效应用于烟草生物碱的分析检测.

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