非水反相色谱法测定球虫感染后三黄鸡血清中类胡萝卜素的含量

王德圣 李永胜 赵 剑

自然界中已发现的类胡萝卜素有600种，都可以看作是从β-胡萝卜素衍生而来的。但只有很少一部分类胡萝卜素能有效的沉积在禽体内。

类胡萝卜素从吸收入血液到沉积到相关部位受到很多因素的影响，其中疾病的感染最为严重。Ruff等（1974）报道了鸡在常见的6种球虫感染后，血清中类胡萝卜素含量在感染后的6～8 d都明显下降；Koutsos等（2003）报道了注射LPS或IL-1引起的血浆中类胡萝卜素含量发生变化。血液类胡萝卜素含量对疾病感染的敏感性引起了研究者的兴趣，而准确测定血液中类胡萝卜素含量的方法还有待完善。另外，测定血液中类胡萝卜素含量有利于真实准确地反映其生物学利用率，从而取代依靠饲料类胡萝卜素含量与产品色泽相关关系这一粗放的评价指标。

高效液相色谱法是近10年来应用最普遍的定性、定量检测血液中类胡萝卜素含量的方法。Waysek提出了以正相色谱法分离类胡萝卜素的标准，但是柱填料硅胶会促进类胡萝卜素的分解。采用常规反相色谱由于流动相中含有一定量水，导致洗脱类胡萝卜素这类非极性组分的峰型不对称，甚至还会发生组分的柱上沉淀。非水反相色谱法被认为是当前测定生物组织类胡萝卜素含量最好的方法（Su等，2002；Furr，2004），但这类研究以人血液为样本，分离的结果中没有出现对角黄素（Canthaxanthin）和Apo类胡萝卜素酯（Apo-Carotenioc ester）的特征描述，而这恰是家禽饲料中应用最多的两种色素成分。

本实验在前人研究的基础上，建立了一种非水反相液相高效色谱测定血液中角黄素和Apo类胡萝卜素酯的分析方法，并比较了在堆型或柔嫩艾美尔球虫感染下血清中这两种物质的变化。

1 实验部分

1.1 主要设备和试剂

Waters2690高效液相色谱仪，Nova-Pak C18色谱柱（300 mm×3.9 mm ID，5 μm），UV-100紫外可见光检测器，Sigma-2K15型低温高速离心机，IKA-MS1型旋涡混匀机，KQ-250B型超声波清洗机。

甲醇、乙腈和四氢呋喃均为色谱纯，无水乙醇、正己烷和抗坏血酸为分析纯。角黄素和Apo类胡萝卜素酯标准品购自Sigma公司，纯度96%。

分别精确称取0.0040 g的角黄素和Apo类胡萝卜素酯标准品，用甲醇：乙腈：四氢呋喃为75：20：5混合液定容到 100 ml制成储备液（40 μg/ml），再分别稀释制成 2、4、6、8、10 μg/ml用于标准曲线的测定。

1.2 样品的采集和制备

1.2.1 样品采集

144只三黄鸡平均分成A、B、C 3组。饲料按NRC家禽营养需要标准配制，角黄素和Apo类胡萝卜素酯在 0～21、22～29、30～42 日龄的饲料中添加量分别是30、35、19.5 mg/kg 和 15、25、14 mg/kg。在第 21 日龄时，B组每羽嗉囊接种3×104个堆型艾美尔球虫孢子化卵囊；C组每羽嗉囊接种1.5×104个柔嫩艾美尔球虫孢子化卵囊；A组作为对照组。分别在感染后的第0、7、14 d每组选6只鸡各抽取2 ml血液，自然凝固后在4℃下5000 r/min离心15 min，收集血清，保存在-30℃冰箱备用。

1.2.2 样品制备

用移液枪精确吸取100 μl血清样品置于5 ml聚乙烯离心管中，加入100 μl无水乙醇后振荡，再加入1 ml正己烷，2000 r/min旋涡混匀1.5 min，然后在4℃下15000 r/min离心3 min后用移液枪收集上清液。将离心管中的沉淀破碎后再加入1 ml正己烷，超声水浴3 min后取出，重复上述旋涡混匀和离心过程。将两次的上清液合并后加入0.5 ml双蒸水，重复上述旋涡混匀和离心过程，之后用移液枪精确吸取0.5 ml正己烷相置1 ml聚乙烯离心管中，氮气吹干后用200 μl流动相溶解。制成的样品密封后放置于-30℃冰箱中避光保存，8 h内过色谱仪测定。

1.3 色谱条件

流动相为甲醇：乙腈：四氢呋喃按照75：20：5（v： v： v）配制，然后加 0.05%（w： v）抗坏血酸。流速为1.0 ml/min，检测器检测波长450 nm，压力30 bar，柱温 20 ℃，进样量 20 μl。

2 实验结果

2.1 标准物质的特征和标准曲线的制备

分别取2种类胡萝卜素各浓度的标准液20 μl依次进样。记录出峰时间和出峰面积，计算每种物质的平均出峰时间，用外标峰面积法测定线性关系。

角黄素和Apo类胡萝卜素酯标准样品的色谱图见图1。

图1 黄体素、角黄素和Apo类胡萝卜素酯标准样品色谱图

在本实验条件下，角黄素和Apo类胡萝卜素酯的保留时间分别是：（4.69±0.04）min 和（5.72±0.10）min（n=5）。

以各类胡萝卜素的质量浓度为纵坐标，相应峰面积为横坐标绘制2条标准曲线：角黄素，Y=5×10-6X-0.3169（R2=0.9924）；Apo 类胡萝卜素酯，Y=3×10-6X-0.2325（R2=0.9991）。

2.2 回收率实验

采用加标回收法。取同一样品0.7 ml均分成7份，其中6份加入已知量的角黄素和Apo类胡萝卜素酯标准物质，另1份作为对照。按1.2节中样品制备方法进行处理，色谱测定的结果见表1。

2.3 样品色谱分离情况（见图2）

表1 方法回收率（n=6）

图2 血清样品中类胡萝卜素的色谱图

图2为血清样品中类胡萝卜素的色谱图。在本实验选定的分离条件下，鸡血清样品可分离出4种物质。对照图1可见，血清样品中的角黄素和Apo类胡萝卜素酯有着各自明显的特征峰，得到了很好的分离。血清样品中最早分离出的物质（t保留=4.07±0.01）与黄体素（Lutein）在本实验条件的保留时间一致（见图1）。

2.4 不同球虫感染后血清中类胡萝卜素的变化

采用本实验方法测定鸡球虫感染后第0、7和14 d血清中角黄素和Apo类胡萝卜素酯的含量，结果见表2和图3。从表2、图3可见，当饲料中添加量减少，血清中该类胡萝卜素的含量呈现出相应的变化。球虫感染后，血清中的角黄素和Apo类胡萝卜素酯水平都出现了显著的下降趋势，但出现的时间在不同球虫感染中相差很大。

表2 不同球虫感染后不同时间血清角黄素和Apo类胡萝卜素酯的含量（μg/ml）

图3 球虫感染后2周鸡血清中角黄素和Apo类胡萝卜素酯含量变化曲线

3 分析和讨论

3.1 实验方法评估

3.1.1 方法学对回收率的要求在95%～105%，但有些方法操作步骤繁复，可要求在90%～110%。而相对标准偏差（RSD），一般要求应根据样品含量高低和含量测定方法的繁简确定，如含量很低一般不大于5%；含量较高的，则应从严要求。

本实验建立的测定方法对角黄素和Apo类胡萝卜素酯的回收率分别是99.7%和102.0%，RSD分别为5.25%和4.28%，符合方法学的要求。

3.1.2 鸡血清样品在本实验中分离出4种物质，其中1、3和4号物质通过与标准物质的比较可以确定依次是黄体素、角黄素和Apo类胡萝卜素酯。Barua（1992）使用与本实验相近的方法在人血清中也分离出1号和2号物质，并认为2号物质为玉米黄质（Zeaxanthin）。黄体素和玉米黄质都是玉米、玉米蛋白粉中主要的类胡萝卜素，二者是位置异构体（见图4）。色谱分析结果表明，本实验条件下还不能很好的分离这样的异构物质。

图4 黄体素（Lutein）和玉米黄质（Zeaxanthin）的结构式

3.2 球虫感染的影响

不同种的球虫感染对血清中类胡萝卜素含量变化的影响并不一致。堆型艾美尔球虫感染后血清类胡萝卜素变化的规律与Ruff等（1974）的报道一致。而柔嫩艾美尔球虫降低血清中类胡萝卜素含量出现在感染的7 d之后并影响到感染后的第14 d，这是以往研究中所未曾提及的。引起这一现象的原因尚不清楚，可能与本实验感染球虫卵的数目较低有关。

[1]Barua A B,Harold,C.Furr,et al.Simultaneous analysis of individual carotenoids,retinol,retinyl esters,and tocopherols in serum by isocratic non-aqieous reversed-phase HPLC[J].Food Chemistry,1992,46:419-424.

[2]Harold C.Furr.Analysis of retinoids and carotenoids:problems resolved and unsolved[J].TheJournal of Nutrition,2004,134:281s-285s.

[3]Koutsos A.Elizabeth,C.Christopher,et al.The effect of an acute phase response on tissue carotenoid levels of growing chickens(Gallusgallusdomesticus)[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part A,2003,135:635-646.

[4]Ruff M D,W.M.Reid,J.K.Johnson.Lowered blood carotenoid levels in chickens infected with coccidia[J].Poultry Science,1974,53:1801-1809.

[5]Su Qing,Kevin G.Rowley,Nicholas,et al.Carotenoids:separation methods applicable to biological samples[J].Journal of Chromatography B,2002,781:393-418.