不同产地山茱萸中熊果酸与齐墩果酸含量研究

金德庄，张 聪

(1.上海市食品药品监督管理局认证审评中心，上海 200021;2.上海市中药研究所，上海 200002)

山茱萸具有补益肝肾、收敛固涩的功效，主要含有有机酸、环烯醚萜类、皂苷、多糖等。文献[1]采用高效液相色谱(HPLC)法，以齐墩果酸或熊果酸为指标分析山茱萸的质量。对山茱萸进行定量分析，大多是针对熊果酸，而对齐墩果酸和熊果酸同时进行含量测定的报道则极少。《中国药典(一部)》采用薄层扫描法对六味地黄丸中山茱萸的有效成分熊果酸进行了定量分析，但操作烦琐，显色误差大，重现性差。本试验采用反相HPLC法，通过优化色谱条件来实现熊果酸与齐墩果酸的同时测定，报道如下。

1 仪器与试药

Waters 510型 HPLC Pump，Waters 996 PDA检测器(美国 Waters公司);Millennium 32软件色谱工作站;SY3200型超声波(上海声源超声波仪器设备有限公司)。甲醇、乙腈(美国Merks公司);齐墩果酸对照品(批号为709－8903，中国药品生物制品检定所);熊果酸对照品(批号为77－52－1，MP Biomedicals Znc);其余试剂均为分析纯(中国医药集团上海化学试剂有限公司);水为蒸馏水。山茱萸样品见表1，均经上海市药材公司王依群副主任药师鉴定;除河南南阳产的药材(1)是2002年采收，其余皆采收于2003年。

表1 不同产地的山茱萸样品表

2 方法与结果

2.1 色谱条件优化

流动相选择:山茱萸的主要成分包括非极性成分齐墩果酸与熊果酸，两者都属于大分子的有机酸，结构相似，极性相近，选择合适的流动相分开这两个成分的色谱峰，使分离度(Rs＞1.5)达到一定要求是本次试验的难点之一，故流动相的选择是关键。经多次试验，最终确定流动相为乙腈－0.1%磷酸－甲醇(40∶10∶30)。

流动相流速选择:考察了流动相不同流速(0.6，0.8，1.0mL/min)对分离组分的影响。结果流速对样品的分离效果无影响，但可影响组分出峰时间的快慢。其中流速为0.6 mL/min时保留时间过长，流速为1.0 mL/min时保留时间较好，但流速大可引起色谱仪的柱压过高，故选用0.8 mL/min为流动相流速。

检测波长选择:精密称取山茱萸药材粗粉，用无水乙醇超声30 min，挥干、水溶出，用氯仿萃取，氯仿液挥干，用甲醇定容至20 mL。按拟订的色谱条件测定，波长范围在200～400 nm[2]。比较

了多波长下的色谱图，最后选择210.2 nm为检测波长，此时色谱图出峰数多、峰面积大，可提供的信息多，灵敏度高。

2.2 样品处理方法优化

提取方法选择:精密称取样品1 g，置圆底烧瓶中，加入40 mL无水乙醇，水浴60℃，回流提取2 h，过滤后，滤液置50 mL量瓶中，定容至50 mL，结果见图1。精密称取山茱萸药材粗粉5 g，加无水乙醇30 mL，超声提取30 min，提取液挥干，水溶出，用氯仿萃取3次，挥干氯仿，甲醇定容10 mL。结果见图2。综合考察，选择无水乙醇超声提取为样品提取方法。

图1 乙醇回流提取色谱图

图2 乙醇超声提取色谱图

提取溶剂选择:精密称取样品粗粉(20目)，分别采用95%乙醇、无水乙醇、加热回流及超声提取，用氯仿、乙醚索氏提取。通过对上述几种溶剂的提取效果进行分析，结果采用无水乙醇提取的样品虽然极性成分与非极性成分的比例仍相差较大，但可见提取得到的齐墩果酸和熊果酸成分峰。在此基础上，对无水乙醇超声提取液进行氯仿萃取，可去除部分极性成分。结果经过氯仿萃取的样品中齐墩果酸和熊果酸的相对含量明显提高，可以进行含量测定。

萃取次数考察:精密称取山茱萸粗粉5 g，加无水乙醇50 mL，超声提取30 min，提取液挥干，加50 mL水溶解，加50 mL氯仿萃取2，3，4次，挥干氯仿，甲醇定容20 mL，测定齐墩果酸与熊果酸的含量。结果表明，采用3次萃取即可使待测成分完全转移，故确定的萃取方法为加氯仿萃取3次、每次50 mL。

超声提取条件选择:从无水乙醇对山茱萸药材的提取方法考察来看，采用热回流和超声提取效率相同，且超声提取省时省力，故采用超声提取。超声提取过程的主要影响因素包括溶剂加入量、超声时间及超声提取次数。正交试验结果表明，超声提取最佳条件是10倍量的无水乙醇、提取2次、每次30 min。

2.3 色谱峰定位与纯度鉴定

精密称取华宇产山茱萸药材粗粉5 g，加无水乙醇50 mL，超声提取2次，每次30 min，提取液挥干，加水适量溶解，等体积氯仿萃取3次，氯仿液挥干，甲醇定容20 mL，进样10 μL，测定。在利用色谱法定性时，关键是需要确认所分离出来的色谱峰是纯组分，还是包含了其他化合物(不纯组分)，这仅从UV检测器的色谱仪所提供的色谱图来作判断是不够的。而PDA检测器的色谱仪就能判断色谱峰的纯度，它从2个方面入手，一是分析待测成分与其标准对照品的紫外光谱图是否一致。二是纯度角与纯度阀值的比较。取2.2项萃取次数考察试验中样品，进样测定，记录色谱峰纯度角及纯度阈值。结果见表2。可见，待测峰纯度符合要求，可以进行含量测定。

表2 待测成分峰纯度鉴定

2.4 含量测定

2.4.1 色谱条件

色谱柱:YMC －PACK ODS－A 柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈 －0.1%磷酸 －甲醇(40 ∶10 ∶30);检测波长:210.2 nm;流速:0.8 mL/min;进样量:10 μL;柱温:25 ℃。

2.4.2 方法学考察

标准曲线制备:分别精密称取齐墩果酸对照品15.2 mg或熊果酸对照品32.8 mg，以甲醇定容至10 mL，配制质量浓度分别为1.52 mg/mL 和 3.28 mg/mL 的对照品溶液，分别精密吸取 0.25，0.50，1.00，1.50，2.00 mL，定容至 10 mL，进样 10 μL，测定峰面积，以峰面积对进样量进行线性回归。得回归方程齐墩果酸 Y=－9 318.585+5 942 790 X(r=0.999 9)，熊果酸 Y= －28 338.061+4 698 400 X(r=0.999 5)。结果表明，齐墩果酸与熊果酸进样量分别在0.38 ～3.04 μg和0.82 ～6.56 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:分别精密吸取齐墩果酸与熊果酸对照品溶液，连续进样5次。结果齐墩果酸和熊果酸峰面积的 RSD分别为1.21%和 2.22%(n=5)。

稳定性试验:精密吸取同一供试品溶液，每间隔30 min进样。结果显示供试品溶液在2.5 h内稳定。

重现性试验:精密称取山茱萸粗粉5份(每份5 g)，照样品处理方法处理后，进样测定。结果齐墩果酸和熊果酸含量的 RSD分别为 2.22%和 1.99%(n=5)。

加样回收试验:分别精密称取已知含量(齐墩果酸含量0.399 mg/g，熊果酸含量1.42 mg/g)的山茱萸粗粉6份，每份约2.5 g，平均分成3组，依次加入一定量的齐墩果酸、熊果酸对照品，按样品处理方法处理，进样测定，记录峰面积，计算回收率。结果见表3。

表3 齐墩果酸与熊果酸加样回收试验结果(n=6)

2.4.3 样品含量测定

取不同产地的山茱萸，60℃下干燥至恒重，粉碎过20目筛，分别称取5 g，按样品处理方法处理，每个样品平行制备3份，测定齐墩果酸、熊果酸含量，取平均值，结果见表4。

表4 不同产地山茱萸中齐墩果酸、熊果酸含量测定结果(n=3)

3 讨论

山茱萸是各成药方中的臣药，主要含有齐墩果酸、熊果酸、苹果酸、没食子酸等[3]。其中熊果酸能明显降低血糖、尿糖[4－5]，齐墩果酸有较强的抑菌、强心、利尿和保肝作用[6]，这两个成分是山茱萸的主要指标成分。2000年版《中国药典(一部)》山茱萸项下对熊果酸的含量测定采用薄层扫描法[7]，但由于熊果酸和齐墩果酸均属于三萜酸，在化学结构上又是异构体，且两者极性几乎无区别，在薄层板上应用药典中的条件无法分离开。目前文献报道中，多数未将齐墩果酸与熊果酸分离，测得量实际为二者之和[8－9]。且这两种成分在天然植物中似乎又是共存的[10]。本试验采用反相高效液相色谱法，使两者成分分离是试验难点。流动相的选择是关键，采用乙腈－0.1%磷酸－甲醇(40∶10∶30)作为流动相，在反相柱上，甲醇比例增减对两者分离与保留均有较大影响，增加适量的磷酸，使它产生弱酸性环境，既有利于两种三萜酸分离，又改善了峰形。

本试验首次采集了来自不同产地的山茱萸样品，且同时测定了样品中齐墩果酸和熊果酸的含量，这为山茱萸在成药制剂中药材的选择提供了一个可靠、科学的依据。本试验还首次利用PDA检测器对所定量的4个组分色谱峰进行识别和纯度分析，通过样品中色谱峰和对照品紫外光谱图对照和纯度角证明，所测成分纯度很高，定量准确，从而也证明了文中所优化的色谱条件是可行的。

[1]王晓红.山茱萸几种不同炮制品的熊果酸含量测定[J].中成药，2000，22(7):480.

[2]段天璇，王静竹，冯 鹏，等.山茱萸炮制前后没食子酸溶出及煎出量比较[J].中国中药杂志，1999，24(4):213.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社，1990:19.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社，1995:21.

[5]赵武述，张玉琴，李 洁，等.山茱萸成分的免疫活性研究[J].中草药，1990，21(3):17.

[6]王 鹏，张忠义，吴 忠.熊果酸在药用植物中的分布及药理作用[J].中药材，2000，23(11):717.

[7]刘 伟，李兴奇.山茱萸中熊果酸及齐墩果酸的成分分析[J].河南中医药学刊，2000，15(5):15.

[8]李克明，杨小江，俞敏倩，等.薄层扫描法测定山茱萸中马钱素的含量[J].中国中药杂志，1994，19(12):738.

[9]顾世海，谢 忱，张 丹，等.HPLC法直接测定山茱萸中马钱素的含量[J].中国中药杂志，1996，21(7):429.

[10]张兰桐，刘伟娜，王春英，等.HPLC法测定山茱萸注射液中马钱素和莫诺苷的含量[J].天然产物研究与开发，1999，11(4):49.