高效液相色谱法测定人血浆中盐酸伪麻黄碱质量浓度

李 丽，高运军，吴 尧

(江苏省南京市中医院，江苏 南京 210001)

盐酸伪麻黄碱是麻黄碱的一种差向异构体，常用于治疗呼吸道黏膜充血、水肿。有关伪麻黄碱血药浓度的测定方法报道较多，如高阶导数光谱法[1]、电化学法[2]、串联质谱法[3]、双波长薄层扫描法[4]及高效毛细管电泳分离电导法[5]等，使用最多是高效液相色谱(HPLC)法。笔者对测定人血浆中盐酸伪麻黄碱的HPLC法进行了研究，报道如下。

1 仪器与试药

LC－10AVP型高效液相色谱仪，包括LC－10AD型泵、SPD－

10AVP型检测器、LC－solutions色谱系统(日本Shimadzu公司);FA1004型分析天平(上海天平仪器厂);MDF－382E超低温冰箱

(日本三洋公司)。盐酸伪麻黄碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号为171237－200304);盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号为713－9404);空白血浆(南京市中医院药理室，－20℃保存，有效期至2010年10月23日);甲醇(批号为20050308)、乙腈(批号为20050519)均为HPLC级，其他试剂均为分析纯，实验用水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:ODS 柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:60 mmoL/L十二烷基硫酸钠、60 mol/L磷酸二氢钠水溶液(磷酸调pH=3.5)－乙腈(40∶60);流速:1 mL/min;检测波长:213 nm;进样量:40 μL;柱温:30℃。

2.2 溶液制备

精密称取十二烷基硫酸钠(SDS)17.511 1 g，置锥形瓶中，加水500 mL，超声溶解，再加入磷酸二氢钠9.362 9 g，混匀，加水至1 000 mL，超声溶解，再加三乙胺3 mL，混匀，用磷酸调pH=3.57(加磷酸约 1.5 mL)，经 0.45 μm 尼龙膜过滤，备用，即制得流动相。精密称取盐酸小檗碱对照品0.016 1 g，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得质量浓度为322 μg/mL的盐酸小檗碱内标贮备液;精密量取内标贮备液5 mL，置50 mL量瓶中，用甲醇配成32.2 μg/mL的盐酸小檗碱内标溶液。精密称取盐酸伪麻黄碱对照品7.9 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成质量浓度为790 μg/mL的盐酸伪麻黄碱贮备液;精密量取该贮备液1 mL，置5 mL量瓶中，用甲醇配成质量浓度为158 μg/mL的盐酸伪麻黄碱标准品溶液。

2.3 样品处理

取1 mL血浆样品，精密加入30 μL盐酸伪麻黄碱标准品溶液(158 μg/mL)，混合均匀，从中吸取 0.5 mL 混合液，置另一装有0.5 mL血浆样品的试管中，同样方法操作5次，得到7份质量浓度逐级减半的盐酸伪麻黄碱标准品血浆混合液，每份中加入内标溶液(盐酸小檗碱 32.2 mg/mL)20 μL，混合碱液 0.5 mL，涡旋 2 min，加乙醚4 mL，涡旋2 min，吸取上清液另放;原试管中再加乙醚4 mL，涡旋2 min，吸取上清液，合并两上清液;逐份加入0.1 mol/L H2SO4100 μL，涡旋 2 min，离心 4 min，弃去乙醚，取 40 μL 进样。

2.4 方法学考察

标准曲线绘制及最低检测限确定:于空白血浆中加入不同质量浓度的盐酸伪麻黄碱标准品溶液适量，药物质量浓度分别为0.0740625，0.148125，0.29625，0.5925，1.185，2.37，4.74 μg/mL，按前述方法提取、测定。在上述色谱条件下，盐酸伪麻黄碱、内标的峰形对称，与内源性杂质分离良好;盐酸伪麻黄碱保留时间为5.7 min，内标保留时间为9.9 min。以盐酸伪麻黄碱与内标峰面积比值为纵坐标(Y)、进样质量浓度为横坐标(X)绘制标准曲线，得标准曲线方程为 Y=0.689 9 X+0.051 9，r=0.999 7(n=7)。结果表明盐酸伪麻黄碱血浆样品进样质量浓度在70～4 000 μg/L范围内与峰面积比值线性关系良好。人空白血浆、血浆样品色谱图见图1。为了研究在本色谱系统下盐酸伪麻黄碱的最低检测浓度，按上述方法重新配制血浆样品，浓度分别为 0.8，0.4，0.2，0.1，0.05，0.025 μg/mL，结果线性关系良好，故在本试验条件下盐酸伪麻黄碱的最低检测质量浓度为0.012 5 μg/mL。

图1 高效液相色谱图

精密度试验:按回收率项下方法配制盐酸伪麻黄碱血浆，提取后测定。以1 d内5次测定的盐酸伪麻黄碱浓度计算日内精密度。另在1周内取上述盐酸伪麻黄碱血浆每日各测定1次，计算日间精密度。结果低、中、高血浆日内 RSD分别为6.366%，5.595 1%，4.730 5%(n=5)，日间 RSD 分别 为 18.667 7% ，11.704 1% ，7.508 8%(n=7)。

提取回收率试验:与空白血浆中加入适量盐酸伪麻黄碱标准溶液，按样品处理项下配制后取 2.37，0.592 5，0.148 1 μg/mL 3种质量浓度的血浆，按前述方法提取、测定。以1 d内5次测得的盐酸伪麻黄碱浓度计算方法计算提取率，并以其峰面积与相应浓度未经提取的盐酸伪麻黄碱溶液直接进样，所得峰面积的比值计算提取率。结果见表1。

表1 盐酸伪麻黄碱回收率测定结果(n=5)

稳定性试验:考察低、中、高质量浓度血浆样品在室温、反复冻融和长期冷冻的条件下放置一定时间的稳定性。结果其性质能保持稳定，表明生物样品测定可在30 d内进行。

3 讨论

本试验为Ⅰ期临床试验样品测试方法学考察的质量控制部分。文献所报道测定伪麻黄碱血药浓度的HPLC法，用非那西丁作为内标物[6]，但试验中发现，其出峰时间及提取率均不稳定，时常干扰样品出峰等。后经摸索改用盐酸小檗碱作为内标物，结果提取率高，且具有与药物分离良好、对药物无干扰、出峰时间早、峰形好等优点，试验误差也较非那西丁小，较其他内标定物也更准确。在试剂的选择上，试验初期曾使用乙醚－正己烷(1∶1)、正己烷－二氢甲烷－异丙醇(100∶50∶5)作为提取溶剂，但效果不理想，后改用100%乙醚分2次提取，提取率较高，均在60%以上，且含量稳定。盐酸伪麻黄碱血浆蛋白结合率高，分子小，血样处理较烦琐。本试验在流动相的选择配比、血浆的处理上也做了一些改进。

本试验建立了准确、灵敏的测定人血浆中盐酸伪麻黄碱的方法，适用于盐酸伪麻黄碱的药代动力学研究及治疗药物浓度检测。

[1]楼永明.高阶导数光谱在药物分析中的应用[J].福建分析测试，2003，12(2):1 743 － 1 745.

[2]丁祥欢，楚清脆，叶建农.感冒药中盐酸伪麻黄碱和扑热息痛含量的毛细管电泳－电化学法测定[J].分析测试学报，2002，21(3):37－39.

[3]杨汉煜，陈笑艳，徐海燕.液相色谱－串联质谱法测定人血浆中的伪麻黄碱浓度[J].沈阳药科大学学报，2001，18(2):116－119.

[4]温爱平，杨树平，李红英，等.双波长薄层扫描法测定异麻匹林片中咖啡因和盐酸伪麻黄碱含量[J].中国医院药学杂志，2000，20(5):262－264.

[5]郑一宁，谢天尧，莫金垣，等.高效毛细管电泳分离电导检测麻黄碱和伪麻黄碱[J].高等学校化学学报，2002，23(2):199－202.

[6]林观样，王志强，张春红，等.高效液相色谱法测定人血中伪麻黄碱的含量[J].中国医院药学杂志，2005，25(9):824 －826.