大曲中毛霉产蛋白酶发酵条件的研究

李兰,蒋爱凤

（河南科技学院,河南新乡453003）

蛋白酶是酶制剂工业中最重要的工业酶之一,由于其用途广泛,商业价值高,蛋白酶一直是开发和研究的热点[1].蛋白酶分动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶,动物蛋白酶生产周期长价格昂贵,植物蛋白酶原料的生产受土地资源与季节限制,与这两种蛋白酶相比,微生物来源的蛋白酶具有生产周期短、生产成本低、易于管理控制、不受土地和季节限制等优点[2],因此,采用发酵工程技术是生产蛋白酶的优良方法.用于食品生产的蛋白酶可以由多种微生物产生,如地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽胞杆菌（B.subtilis）、灰色链霉菌（Streptomycesgriseus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、寄生曲霉（A.parasiticus）、米曲霉（A.oryzae）、微小毛霉（Mucorpusillus）等[3],其中毛霉含有非常丰富的酶系,仅就蛋白酶而言,可产生酸性蛋白酶、中性蛋白酶以及碱性蛋白酶,既能合成端肽酶,又能分泌内肽酶,因此,毛霉蛋白酶本身是一种天然的复合酶系[4].毛霉蛋白酶特别适宜于各种发酵食品及大豆多肽的制作,已经成为目前研究的热点[5,6].

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 毛霉：河南某酒厂大曲中分离纯化得到；斜面培养基：采用PDA培养基[7]；固体发酵培养基：250 mL的三角瓶中按实验设计加入不同量麸皮,与不同比例的水混合均匀,121℃高温高压灭菌30 min,趁热摇散,备用.

1.1.2 试剂 福林试剂（Folin试剂）；pH 3.0乳酸缓冲液；pH 7.5的磷酸缓冲液；pH 10.5的硼酸缓冲液等；所用试剂均为分析纯.

1.1.3 仪器 电热恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司）；手提式电热蒸汽消毒器（山东安得医疗科技有限公司）；超净工作台（苏州净化设备有限公司）；离心机（德国Sigma公司）；电热恒温培养箱（天津市三水科学仪器有限公司）；722型紫外分光光度计（上海第三分析仪器厂）.

1.2 实验方法

1.2.1 菌种分离 将大曲粉碎,取少量曲粉,以适量体积的无菌水浸泡,加入少量蔗糖,对菌种进行富集培养.用PDA培养基对富集后的菌悬液进行梯度稀释,进行平板分离.待平板上长满单菌落后,取目的菌种接入斜面,于28℃培养2～3 d,即为斜面菌种[8].

1.2.2 毛霉菌种固体培养 在斜面菌种加入10 mL无菌水,充分振荡1 min,用移液管吸取1 mL菌悬液,加入固体发酵培养基中,于28℃培养箱中按实验设计培养不同时间,即得麸曲.

1.2.3 粗酶液的制备 称取5 g曲子,放入研钵中,加入0.3 mol/L的NaCl溶液,捣碎,定容到100mL容量瓶中,40℃浸提30 min.取浸提液在3 000 r/min离心20 min,取上清液进行蛋白酶活力的测定.

1.2.4 酶活力的测定 中华人民共和国专业标准——酶活力测定法[9].

图1 产酶活力的动态曲线

2 结果与分析

2.1 毛霉产酶动态

按照毛霉菌种固体培养方法进行毛霉发酵,依次于 24、48、72、96、120 h取样分别测量碱、中、酸性蛋白酶的活力,每次测量作3个重复,取平均值.产酶动态如图1所示.

由图1可见毛霉产蛋白酶以碱性蛋白酶为主,72 h产酶活最高.酸、中性蛋白酶在前期基本不产生,后期产量也没有碱性蛋白酶高.产酶增长最快的时期是48～72 h,这个时间段也是孢子生长最为旺盛的时期.

由于此毛霉所产蛋白酶以碱性蛋白酶为主,因此在以下的单因素实验中都以所测得的碱性蛋白酶为指标.

2.2 料水比对产酶的影响

称取5g麸皮,以不同的加水量配置料水比分别为1∶1,1∶1.2,1∶1.4,1∶1.6,1∶1.8,1∶2,1∶2.2的培养基,于28℃培养72 h后测酶活.料水比对产酶的影响如图2所示.

图2 料水比对碱性蛋白酶的影响

由图2可见培养基的最合适含水量为61.55%,即麸皮∶水＝1∶1.6配置的培养基.毛霉生长需要一定量的水分,但含水量不宜过高.因为高含水量培养基的曲子容易粘结成团,导致散热困难,而毛霉又是低温生长的菌种,一旦散热不好极容易烧曲,酶活力自然不高.所以培养基含水量要控制在一定的范围内才适合毛霉产蛋白酶.

2.3 扣瓶对产酶的影响

制作7瓶固体培养基进行毛霉菌种固体培养,分别标号为 1、2、3、4、5、6、7号,其中1号不扣瓶作为对照,另外6个在培养 12 h 后,2、3、4、5、6、7 号瓶在后 60 h培养过程中,依次扣瓶 2、3、4、5、6次,培养72 h后测定酶活.扣瓶对产酶活力的影响如图3所示.

图3表明,一定次数的扣瓶处理可以提高酶的产量,但是多次扣瓶处理没有提高酶产量的作用,有可能是扣瓶次数太多了,打碎了曲子菌丝,不利于菌丝体生长,导致产酶量下降.经观察,扣瓶处理的曲子碎散,不扣瓶的曲子密实整齐.最高酶活出现的时候,菌体生长也是最旺盛的时候,这充分说明了良好的菌丝体生长有利于高产酶活.

2.4 麸皮装量对产酶的影响

分别称取 5、7.5、10、12.5、15、17.5、20 g麸皮于 250 mL三角瓶中，按照麸皮与水分 1：1.6比例制作培养基,于28℃培养72 h后测酶活.麸皮装量对产碱性蛋白酶的影响如图4所示.

由图4可以看出麸皮装量为5 g的时候酶活最大,随着麸皮装量的增加产酶活力减少.充足的氧含量及良好的散热水平有利于菌丝的生长及产酶,同样的空间,少的装量可以获得大量的氧供应,同时也利于散热,防止品温过高影响菌丝生长,防止造成烧曲.麸皮装量为7.5 g时酶活与5 g之相当,说明这时已经有足够的供氧、通风及散热,因此如果250 mL三角瓶麸皮装量少于5 g的话,会造成空间的浪费,从而会减少酶的产量,在工业上就会表现为经济效益损失.

2.5 四因素三水平正交试验

在单因素实验的基础上,选用四因素三水平进行L9（34）正交实验,实验设计见表1,实验结果见表2.

图3 扣瓶次数对碱性蛋白酶的影响

图4 麸皮装量对碱性蛋白酶的影响

表1 四因素三水平正交设计

表2 正交实验结果及分析

由极差分析可以看出,各因素影响碱性蛋白酶活力顺序为：B＞C＞D＞A,即培养基的含水量是影响碱性蛋白酶活力的主要因素,其次是扣瓶次数,然后是麸皮装量和培养时间.产碱性蛋白酶最适条件组合为：A2B3C3D1,即培养72 h,含水量64.3%,扣瓶4次,250 mL三角瓶装入麸皮5 g.

将正交试验所得的最佳组合A2B3C3D1做3次重复实验,测定酶活力平均值为846 U/g.

3 结论

3.1 通过毛霉产酶动态的产碱性、中性、酸性酶活性测定,表明从大曲中分离出的毛霉产蛋白酶以碱性蛋白酶为主,其次是中性蛋白酶,产酸性蛋白酶最少.

3.2 通过正交实验分析,可以得到最佳发酵条件为：麸曲培养时间72 h,固体培养基含水量为64.3%,培养期间扣瓶4次,250 mL三角瓶装入麸皮5 g为产酶最好.

3.3 在最优发酵条件下进行毛霉固态发酵产酶达846 U/g.

[1]陈涛.毛霉蛋白酶的制备及水解豆粕的研究[D].武汉：华南理工大学,2004.

[2]张树政.酶制剂工业（第3版）[M].北京：科学出版社,1998.

[3] 胡学智.蛋白酶的生产和应用（上）[J].江苏调味副食品,2006,23（6）：1-4,22.

[4]潘进权,沈月荣,李理,等.固体发酵制备毛霉蛋白酶的研究[J].中国调味品,2006,（3）：9-13.

[5]于丽萍.大豆多肽开发应用潜力巨大[J].杭州化工,2003,33（1）：40.

[6]李理,潘进权,杨晓泉,等.液体发酵法制备风味良好的大豆多肽[J].食品与发酵工业,2003,29（1）：23-26.

[7]陈涛,刘耘,李理,等.毛霉M4固体发酵产蛋白酶的研究[J].中国酿造,2004,（4）：16-18.

[8]周德庆.微生物学教程[M].上海：复旦大学出版社,1987：82-87.

[9]须凤高.中华人民共和国专业标准——酶活力测定法[S].中华人民共和国共和国商业部,1987.