大肠杆菌氨基酰化酶工程菌的固定化研究

大肠杆菌氨基酰化酶(ACY1)工程菌能特异性催化水解N-乙酰-L-氨基酸，主要用于氨基酸的手性拆分。ACY1广泛存在于动物肝肾组织中和一些微生物体内，这与其生理功能密切相关。目前，普遍认为ACY1在生物体内执行蛋白质代谢后的氨基酸挽救功能。

工业上用于氨基酸拆分的ACY1主要来源于猪肾和黑曲霉，其中猪肾ACY1酶活力较高，但需要从猪肾组织中提取，其来源有限、成本较高。为了扩大猪肾ACY1的酶源，作者运用分子生物学的方法成功构建了大肠杆菌工程菌，能高效表达活力和天然酶相当的重组猪肾ACY1。在此对该工程菌进行了固定化研究，为重组猪肾ACY1在氨基酸生产工业中的大规模应用奠定基础。

1 实验

1.1 菌种与培养基

大肠杆菌氨基酰化酶工程菌ROSETTA (DE3)/ pET28a-pacy1，自行构建并保存。

LB培养基( g·L-1)：酵母粉5,蛋白胨 10,氯化钠 10，pH值7.0。

1.2 试剂与仪器

氯化钠、硼酸、无水氯化钙、醋酸、醋酸钠、N-乙酰-L-蛋氨酸、茚三酮、正丁醇、冰乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、葡萄糖、尿素、95%乙醇、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·5H2O，分析纯；聚乙烯醇(PVA)、海藻酸钠(SA)、琼脂，化学纯。

2HWY-2112B型恒温振荡器；TGL-16C型离心机，上海安亭科学仪器厂；320-S型pH计； U-3000型分光光度计，日本 Hitachi公司；HL-2S型蠕动泵，上海沪西分析仪器厂有限公司；HH-2型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液的制备

接种重组菌ROSETTA (DE3)/pET28a-pacy1的单菌落于LB 液体培养基中，于37℃、250 r·min-1振荡培养过夜，次日将过夜培养物继续于37℃、300 r·min-1振荡培养至OD600=0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度0.2 mmol·L-1,继续培养3 h，离心收集菌体，并用0.1 mol·L-1磷酸缓冲溶液 (pH值7.0)清洗。于3000 r·min-1、4℃离心3次，洗涤，重悬,制得一定浓度菌悬液，立即使用。

1.3.2 固定化细胞的制备

1.3.2.1 PVA固定化细胞的制备[1]

取9 g PVA加入90 mL水，加热至沸腾并不断搅拌至充分溶解，冷却至室温，加水定容至100 mL，灭菌，冷却至40℃，按1∶10的菌胶比将一定浓度的菌悬液加入到PVA溶液中，充分混匀。然后用蠕动泵滴入5%硼酸(用低浓度氢氧化钠溶液调pH值至7.0)中，固定化24 h。用生理盐水洗净，备用。

1.3.2.2 SA固定化细胞的制备

取2 g SA加入100 mL水，在60℃恒温水浴锅中加热溶解，冷却至室温，加水定容至 100 mL，灭菌，冷却至40℃，按1∶10的菌胶比将一定浓度的菌悬液加入到SA溶液中，充分混匀。然后用蠕动泵滴入2%氯化钙溶液中，固定化24 h。用生理盐水洗净，备用。

1.3.2.3 PVA-SA固定化细胞的制备

取11 g PVA和1 g SA，加入100 mL蒸馏水，水浴加热至溶解并混匀,灭菌，冷却至40℃，与15 mL菌悬液混合。然后用蠕动泵滴入饱和硼酸-2%氯化钙溶液中，固定化24 h。用生理盐水洗净，备用。改变PVA、SA质量分数及固定剂用量进行固定化。

1.3.3 固定化细胞颗粒机械强度及粒径测定

1.3.3.1 机械强度测定[2]

机械强度以球径变化率(X)表征，变化率高则机械强度低。取粒径相当的多个固定化凝胶颗粒，用干净滤纸吸去表面的水，均匀置于两片平面玻片之间，用游标卡尺测玻璃片间距r0，再将50 g的砝码均匀放置在玻璃片上，用游标卡尺测变化后的玻璃片间距r。球径变化率X=[(r0-r)/r0]×100%。

1.3.3.2 固定化颗粒体积和平均直径的测定

取经充分浸润的固定化凝胶颗粒，用滤纸吸干其表面附着水分，先在量筒内加入一定体积蒸馏水V1，再加入颗粒，此时，总体积为V2。所测的颗粒体积V=V2-V1。

取20粒固定化凝胶颗粒排列成直线，测其总长度，计算固定化凝胶颗粒的平均直径[3]。

1.3.4 酶活力的测定

ACY1酶活测定采用酸式茚三酮法[4]。(1)吸取2 mL 0.04 mol·L-1N-乙酰-L-蛋氨酸溶液(pH值7.0)加入到试管中，加入0.2 mol·L-1磷酸钾缓冲溶液(pH值7.0)2 mL，于37℃恒温水浴中保温至平衡。(2)在试管中加入1 mL酶液，摇匀，每隔3 min吸取0.5 mL反应液加入已有0.5 mL 0.5%三氯乙酸的试管中，立即摇匀终止反应。(3)各试管中分别加入1 mL醋酸缓冲溶液(pH值5.4)和1 mL 0.5%茚三酮溶液，摇匀后放入90～100℃热水中，反应15 min，用自来水冷却约5 min至室温。(4)每管加入3 mL 60%乙醇，稀释摇匀，测定OD570值。(5)利用已知浓度的Met溶液绘制标准曲线，根据标准曲线可知反应液中产物的浓度，从而计算相应时间段的酶反应速度。

酶活力定义：在25℃，每分钟水解1 μmol·L-1N-乙酰-L-蛋氨酸所需的酶量为一个酶活力单位。

2 结果与讨论

2.1 固定化载体的选择

采用不同的固定化载体固定ACY1工程菌，结果见表1。

表1 不同固定化载体的固定化效果

由表1可知,9%PVA 固定化细胞颗粒弹性好，但是平均变化率最高，即机械强度最低，且其成球性差，颗粒粒径过大;2%SA及1%PVA-3%SA固定化颗粒的粒径大小适中，成球性好，但是弹性不好，其中2%SA固定化颗粒的机械强度也低、1%PVA-3%SA固定化颗粒的机械强度大幅提高；10%PVA-1%SA固定化颗粒的平均变化率为3.07%，其机械强度明显高于其它三种，弹性也好，受压后易于恢复，粒径大小也适中，但其成球性不是很好(出现拖尾)，这可以通过改变PVA比例来改善。综合考虑，选择PVA-1%SA复合载体来制备固定化颗粒。PVA所占比例较高，可提高弹性，有利于提高机械强度；适当加入少量的SA可使成球性变好，粘连降低，小球机械强度和活性提高;粒径越小，固定化收率和酶活越高，这是因为较小的颗粒具有良好的扩散性。

2.2 PVA质量分数对PVA-1%SA复合载体固定化效果的影响[5](表2)

表2 PVA质量分数对PVA-1%SA复合载体固定化效果的影响

由表2可知，PVA质量分数为8%时复合载体的固定化效果最好，因此，选择8%PVA-1%SA为适宜的固定化材料(分别采用不同质量分数的PVA溶液及1%SA作载体，包埋相同浓度的菌悬液时，当PVA质量分数低于8%时，固定化细胞的机械强度较差，不易成球，在使用过程中容易溃破，所以这里不予考虑)。

2.3 固定剂用量及pH值的选择

改变固定剂用量及pH值制备固定化颗粒，结果见表 3。

表3 固定剂用量及pH值对固定化效果的影响

由表3可知，适宜固定剂为pH值6.7的3%硼酸-1%氯化钙。

2.4 固定化细胞与游离细胞酶活力的比较

将相同菌比的固定化细胞和游离细胞按1.3.4方法测定其OD570(本实验以OD570值表征酶活力大小，其值越高，L-半胱氨酸含量越高，则单位时间内转化的产物量越高即酶活力越高)。不同保存条件下固定化细胞与游离细胞的OD570测定结果见表4。

据表4中的OD570平均值绘制曲线，以直观比较固定化细胞和游离细胞的酶活力，结果见图1。

图1 保存时间对固定化细胞与游离细胞酶活力的影响

由图1可知，当固定化细胞刚制备出来时，酶回收率(固定化细胞酶活与游离细胞酶活之比)高达91.46%；4℃下保存7 d后，固定化细胞和游离细胞的酶活力均有所下降，但是下降幅度不大，分别为5.37%和13.50%；再室温保存7 d后，固定化细胞的酶活力下降2.50%，而游离细胞的酶活力大幅下降(降幅51.3%)；再室温保存14 d后，固定化细胞酶活力仍然仅小幅下降，为初始对照的90.76%，而游离细胞的酶活力大幅下降，只有初始对照的29.69%。由此可知，固定化细胞的酶活保留率明显高于游离细胞，这是因为固定化载体对酶有保护作用[6]。

表4 不同保存条件下固定化细胞与游离细胞的OD570测定结果

3 结论

分别以聚乙烯醇(PVA)、海藻酸钠(SA)及PVA-SA为固定化载体对大肠杆菌氨基酰化酶工程菌进行固定。结果表明，PVA-SA固定化凝胶颗粒具有较好的机械强度和稳定性。确定PVA-SA的最佳包埋条件如下：PVA质量分数为8%，SA质量分数为1%，固定剂为pH值6.7的3%硼酸-1%氯化钙。此条件下制备的固定化细胞的酶回收率为91.46%。于4℃保存7 d、再室温保存14 d后，固定化细胞的酶活力为初始对照的90.76%，而游离细胞只有初始对照的29.69%。

参考文献：

[1] 李峰，吕锡武，严伟.聚乙烯醇作为固定化细胞包埋剂的研究[J].中国给水排水,2000,16(12)：14-17.

[2] 林海，许平,周虹.聚乙烯醇(PVA)微珠发酵生产木糖醇能力的改进研究[J].四川食品与发酵，2006，42(5)：26-31.

[3] Sano K，Yokozeki K,Tamura F，et al．Microbial conversion of DL-2-amino-delta 2-thiazoline-4-carboxylic acid to L-cysteine and L-cystine：Screening of microorganisms and identification of products[J]．Appl Environ Microbiol，1977，34(6)：806-810．

[4] 周昌平，怀丽华，白钢,等.酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的酶促反应条件研究[J].生物技术通讯，2006,17(6):911-913.

[5] 王雪梅,于明锐,谭天伟.海藻酸钠复合载体固定化细胞拆分D,L-泛解酸内酯[J].北京化工大学学报(自然科学版),2006,33(3):28-32.

[6] 郑迎迎,李大力.壳聚糖载体的制备及脲酶的固定化研究[J].生物技术，2005,15(2)：56-59.