阿拉瑞林联合5-FU对人子宫内膜癌裸鼠移植瘤的抑制作用

李润连 张三元

子宫内膜癌是原发于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，占女性生殖系统最常见恶性肿瘤的20% ～30%，近些年发病率不断上升。子宫内膜癌的治疗早期以手术为主，但晚期、复发性及年轻要求保留生育能力的患者，以激素及化疗等姑息治疗为主［1］，现有的化疗单药或联合用药方案不良反应大、疗效不佳是其主要缺点。阿拉瑞林是人工合成的促性腺激素释放激素( gonadotrop in-releasing hormone，GnRH)九肽类似物，其药效是母体的15倍［2］。张玉泉等［3］研究表明，它对子宫内膜癌的相关癌基因ras、neu、myc的表达具有调控作用。本研究通过观察阿拉瑞林对子宫内膜癌的促凋亡作用，探讨可能的分子机制，为子宫内膜癌提供新的治疗方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物及细胞株 BALB/Cnu/nu裸鼠，4～6周龄，雌性，体重18～20g购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号:SCXK(京)2007-0001，SPF级环境饲养;人子宫内膜癌细胞株HEC-1B购自中国医学科学院上海研究所。

1.1.2 药物与试剂 阿拉瑞林购自安徽丰原制药有限公司马鞍山制药厂;5-FU购自上海旭东海普药业有限公司;bcl-2试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及动物模型的建立。HEC-1B细胞株用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养。常规培养于含5%CO2的37℃培养箱中。取对数生长期的细胞，在超净工作台以TB空针接种于裸鼠右前肢近腋窝处皮下，每只注射0.1ml(约含5×106个细胞)，接种完毕后将24只裸鼠随机分为4组，每组6只，SPF级环境下饲养1周，成瘤率为100%，开始给药。阿拉瑞林组:背部肌肉注射35μg/kg，药物浓度按每只裸鼠每次注射1.0ml配制，1次/d，连续30d;对照组:相同剂量的生理盐水;5-FU组:腹腔注射5-FU20mg/kg，剂量为1.0ml，1次/d，连续5d;联合组:(阿拉瑞林+5-FU)阿拉瑞林35μg/kg背部肌肉注射30d，5-FU20mg/kg腹腔注射5d。停药后处死裸鼠，剥取肿瘤称重后置于福尔马林液中固定，常规石蜡包埋。

1.2.2 指标检测 抑瘤率(%)=(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。

1.2.3 病理学检查 取石蜡包埋组织，切片、HE染色，光镜下观察肿瘤的病理变化。

1.2.4 免疫组化检测Bcl-2蛋白表达 石蜡切片，常规脱蜡至水。PBS洗3次，2min/次;0.3%H2O2抑制内源性过氧化物酶10min;蒸馏水洗3次，2min/次。热修复抗原，放入0.01M枸橼酸盐缓冲液，微波炉加热至沸腾后断电，间隔10 min，反复2次，冷却后PBS洗3次，2min/次;滴加一抗，浓度为1:50，4℃过夜，PBS洗3次，2min/次;滴加生物素化山羊抗小鼠 IgG，37℃ 40min，PBS 洗 3 次，2min/次;滴加 SABC，37℃ 20min，PBS洗4次，5min/次;DAB 显色，室温 5～15 min，蒸馏水洗涤5min;苏木素轻度复染，脱水、透明、封片。

结果由病理科医师协助分析，胞浆出现棕黄色颗粒为Bcl-2阳性细胞。即根据每张切片的阳性细胞比例及着色深浅积分，两者乘积判断阳性等级，每例组织观察3个连续切片，每片采样3个400倍视野计数，阳性细胞所占的百分比打分:0分为阴性，1分为阳性细胞10%，2分为11% ～50%，3分为51% ～75%，4分为＞75%。再将染色强度打分:0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。将染色强度与阳性细胞百分比的乘积＞3分为免疫组化结果(+)。

1.3 统计学处理 应用SPSS13.0软件包，计量资料以均数±标准差()表示，采用方差分析。率的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 阿拉瑞林对移植瘤重量、抑瘤率的影响(表1)。用药过程中，裸鼠生长良好(图1)。

表1 各组的瘤重及抑瘤率比较()

表1 各组的瘤重及抑瘤率比较()

注:△P＜0.01vs对照组;＊P＜0.01vs阿拉瑞林组

组别 例数 平均瘤重(g) 抑瘤率(%)对照组6 1.8451±0.2052 -阿拉瑞林组 6 1.4572±0.1845△ 21.025-FU组 6 1.2650±0.1675△＊ 31.44联合组 6 0.8127±0.1533△＊55.95

图1 治疗中的裸鼠

表2 各组免疫组化bcl-2的表达比较(例，%)

2.2 阿拉瑞林对裸鼠移植瘤组织形态学观察 对照组瘤细胞密集，细胞有明显异型性，核大深染，可见较多核分裂像，间质较少。治疗组瘤细胞排列较稀疏，可见大片无结构的坏死区，瘤细胞核深染、固缩。

2.3 免疫组化检测Bcl-2蛋白表达结果(表2、图2)。

3 讨论

阿拉瑞林是对天然的促性腺激素释放激素(GnRH)分子结构进行修饰而合成的肽类物质，对人体无毒，作用时间比GnRH长久。因为它能与垂体中特异性受体结合，抑制促性腺激素和性激素的释放，造成性腺功能低下，因此，对与性激素有关的疾病具有良好的治疗作用，对于恶性肿瘤，有直接抑制肿瘤细胞增殖、加速其死亡的作用［4］。目前它已成功用于治疗乳腺癌、卵巢癌及前列腺癌［5］等激素依赖性肿瘤。本实验中，各实验组平均瘤重与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，阿拉瑞林组、5-FU组及联合组两两比较均有显著性差异(P＜0.05)。说明阿拉瑞林对子宫内膜癌有抑制作用，且阿拉瑞林与5-FU在抑制肿瘤生长方面有协同作用。

Bcl-2为凋亡抑制基因，编码Bcl-2，与细胞凋亡关系密切［6］，可稳定细胞内质膜系统、抑制线粒体内离子及细胞色素C的释放从而抑制凋亡的发生，Bc1-2过量表达，抑制细胞死亡［7］。Bax具有对抗Bc1-2抑制细胞凋亡的作用，在细胞内，Bcl-2和bax可以分别形成同源二聚体，也可以互相聚合形成异源二聚体。当细胞接受某些刺激信号后，如果bcl-2高表达，形成Bcl-2/Bax异二聚体增加，细胞免于凋亡;如果Bax高表达，形成Bcl-2/Bax同源二聚体增加，细胞发生凋亡。本实验中发现，阿拉瑞林处理的子宫内膜癌细胞中Bcl-2蛋白表达减少，提示可能通过调节Bcl-2蛋白的表达，进而诱导子宫内膜癌细胞凋亡的发生，可能的作用机制有待进一步研究。实验中还显示阿拉瑞林与5-FU联合在诱导肿瘤细胞凋亡过程中Bcl-2表达明显下调，提示两药合用具有协同抗肿瘤作用，因此阿拉瑞林与化疗药物的联合应用可望降低化疗药物剂量而达到相同的疗效，为子宫内膜癌的治疗提供更为有效的方法。

图2 bcl-2免疫组化(SABC×400)

［1］Kao MS. Management of recurrent endometrial cancer. Chang GungMed J，2004，27: 639-645.

［2］张超，刘欣燕.GnRH的临床应用进展.中国妇产科临床杂志，2007，8(3):229-231.

［3］张玉泉，曹斌融，张惜阴，等.丙氨瑞林对子宫内膜癌ras、myc及p53基因表达调控的研究.南通医学院学报，1999，19(1):19.

［4］田玲，路学智.瑞林类人工合成肽类药物的研究进展.中国新药杂志，2006，15(20):1723-1726.

［5］徐虹，宋磊.子宫内膜癌的激素治疗进展.现代妇产科进展，2007，16(1):62-64.

［6］Shang L，Wwang L，Sun H L，et al. Protective effects of oxyma trineon myocyte apoptosis in rats with acute myocardial ischa ania. ChinPharm J( 中国药学杂志) ，2007，42( 7) : 501-504.

［7］Fan J，Li R，Zhang R，et al. Effect of Bcl-2 and Bax on survival ofside population cells from hepato cellular car-cinoma cells. World JGastroenterol，2007，7: 6053-6059.