高效液相色谱法测定甘草中4种黄酮类化合物

卓 越， 王新春， 甘永祥， 张 华， 边海旭， 陈 文

（1.教育部省部共建新疆特种植物药资源重点实验室，新疆石河子 832002;2.新疆石河子大学医学院一附院，新疆石河子 832008;3.武警新疆森林总队，新疆乌鲁木齐 830013）

甘草中的黄酮类成分是近年来的研究热点［1］。其中甘草苷、异甘草苷、甘草素及异甘草素是甘草中的4种重要黄酮类化合物，近年研究发现甘草苷、异甘草苷、甘草素及异甘草素是抗HIV的有效成分，对其提取分离工艺和临床研究日益受到国内外学者的重视［2］。

目前，用高效液相色谱法测定天然产物中甘草黄酮类化合物已有文献报道［3-7］，但主要是测定甘草及其产品中的其中2种或3种成分含量。对这4种黄酮类化合物含量的同时测定，尤其是对甘草苷、异甘草苷、甘草素及异甘草素的同时测定尚未见文献报道。为此，本试验建立了同时测定甘草中4种黄酮类化合物的高效液相色谱法，简便、快捷、重现性好。

1 仪器与材料

Waters高效液相色谱仪，Delta 600泵，2996型DAD二极管阵列紫外检测器（美国沃特斯公司）;Sartorius BP211D型电子天平（美国）;TP300超声波提取器（北京天鹏电子新技术有限公司）;EZM505201冷冻干燥仪（Crawley England）;乙腈（色谱纯），自制双蒸水，其余试剂均为分析纯。

甘草苷、甘草素、异甘草苷、异甘草素对照品（中国药品生物制品检定所）;甘草购于新疆石河子市一附院药剂科，由石河子大学药学院成玉怀高级实验师鉴定为乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）。

2 实验方法

2.1 甘草总黄酮提取纯化与富集 甘草95%乙醇回流提取液浓缩成稠膏状，石油醚、乙酸乙酯依次萃取3次，乙酸乙酯萃取液用5%Na2CO3和浓盐酸碱提酸沉后，再用乙酸乙酯萃取并减压浓缩，60℃恒温干燥至恒量得棕黄色甘草总黄酮类化合物。将其配成1.5 mg/mL的药液，pH值调至5.0，以3 mL/min速度的上样使AB-8型大孔吸附树脂吸附达到饱和，80%的乙醇溶液洗脱。洗脱液浓缩、冷冻干燥得总黄酮含量为53.15%微黄色粉末备用。

2.2 甘草总黄酮样品液的制备 精密称取甘草总黄酮的冻干粉末2.03 mg于10 mL量瓶中，甲醇定容摇匀，即得。

2.3 对照液的制备 精密称取甘草苷10.42 mg、异甘草苷8.88 mg、甘草素2.78 mg、异甘草素3.07 mg分别于25 mL量瓶中，甲醇定容摇匀，即得。

2.4 色谱条件［3-7］色谱柱:HC-C18ODS色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相A为0.04%甲酸溶液，B为乙腈，作梯度洗脱，梯度洗脱条件:0～15 min，B%为25% ～35%;15～40 min，B%为35%;检测波长为292 nm，柱温为室温，流速为1.0 mL/min;进样量为20 μL。

2.5 检测波长的选择［3-7］甘草苷、异甘草苷、甘草素及异甘草素都属于黄酮类化合物，母核相同，性质相似，经DAD检测器检测在292 nm处4种黄酮类化合物对照品各峰面积比例适中且均有较高的响应值。见图1。

图1 混合对照品在292 nm处的图谱

2.6 标准曲线的制备［4］分别精密吸取4种对照液甘草苷120 μL、甘草素 34 μL、异甘草苷 110 μL、异甘草素 39 μL 于10 mL量瓶中。再分别精密吸取这4种对照液起始体积的2、3、4、5、6、7、8、9 倍，并分别注入各量瓶中，甲醇定容摇匀。精密吸取各浓度的混合对照品溶液20 μL，注入液相色谱仪，按照2.4项下方法测定各浓度对照品峰面积，其线性回归方程及相关系数分别为:甘草苷y=57 623x－16 755，r2=0.999 3;异甘草苷y=53 892x－6 369.6，r2=0.999 1;甘草素y=348 900x+8 458.4，r2=0.999 8;异甘草素y=138 884x+27 344，r2=0.999 4。甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素的线性范围分别为 5 ～36 μg/mL，3 ～28 μg/mL，0.3 ～2.7 μg/mL 和0.4 ～3.4 μg/mL。

2.7 精密度试验［6］精密吸取混合对照品溶液20 μL注入高效液相色谱仪，连续进样6次，测定各自的峰面积，计算得甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素对应的RSD分别为1.05%、2.27%、2.64%和1.55%，表明该方法精密度良好。

2.8 重复性实验［6］取甘草样品6份，按2.2项下方法制备甘草乙醇提取液，平行进样2次，按2.4项下方法测定，并用外标法计算，甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素对应的RSD分别为0.31%、2.12%、2.67和3.11%，表明此方法重现性良好。

2.9 稳定性试验［6］精密吸取同一供试品溶液，分别在4、8、12、16、20、24 h 进样 20 μL，测定甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素含量，其对应的RSD分别为1.03%、1.25%、2.46和3.01%（n=6）。

2.10 加样回收实验［6］分别取甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素对照品适量，加入到已知含量的甘草粉末中，按2.2项下供试品液的制备方法制备样品，测定4种黄酮类化合物的含量，计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收率

3 实验结果

测定甘草总黄酮冻干粉末中四类黄酮类化合物的含量:乙醇提取液在292 nm处的图谱如图2所示。利用标准曲线得出样品中甘草苷为27.72%，异甘草苷为10.87%，甘草素为0.17%，异甘草素为0.01%。样品含量测定结果见表2。

表2 样品含量测定结果

4 讨论

由含量测定结果可以看出，甘草原材料经纯化富集后，甘草苷和异甘草苷的含量较高而苷元甘草素和异甘草素的含量相对较低，说明这种纯化方法不适合于富集苷元。有文献报导酸水解法可以通过水解苷的方式明显提高甘草中苷元的含量［7］，但会减少苷的含量，对同时提高苷和苷元含量不利。

现有文献在测定甘草黄酮类化合物3种或3种以上尤其在同时测定其中的苷和苷元时多采用双波长检测［4，6］，或者在梯度洗脱时间变换同时变换检测波长［8］，操作较复杂，使重现性较差。本试验采用在同一检测波长下同时测出4种黄酮类化合物，大大简化了操作过程，提高了精密度和灵敏度，重现性良好。

本试验分别考察了甲醇-水，乙腈-水（0.5%醋酸），乙腈-水（0.04%甲酸）等体系进行洗脱，结果以乙腈-水（0.04%甲酸）体系进行小范围梯度洗脱得到的色谱峰形较好，且相对稳定。实验中将4个标准品等体积混合进样得出4个标准品的混合图谱，同时测定甘草中甘草苷、异甘草苷、甘草素及异甘草素的含量，简化了甘草黄酮类化合物含量测定，为其指纹图谱的研究奠定了基础。

图2 甘草乙醇提取液在292 nm处的图谱

［1］张 波，刘会洲，官月平，等.乌拉尔甘草中黄酮类化学成分的研究进展［J］.中成药，2006，28（9）:1362-1365.

［2］付玉杰，祖元刚，侯春莲，等.超临界CO2萃取异甘草素的提取工艺［J］.应用化学，2007，24（1）:67-70.

［3］杨玲娟，赵晓莉，狄留庆，等.HPLC法测定芍药甘草汤总有效部位中4个活性成分的含量［J］.中华中医药学刊，2007，25（3）:522-523.

［4］赵晓莉，崔小兵，吴 皓，等.HPLC双波长法测定复方甘草合剂中甘草苷、甘草素及异甘草素的含量［J］.中成药，2002，24（3）:176-178.

［5］Liu Y，Yang J S.Determination of liquiritigenin，liquiritin，isoliquiritigenin and isoliquiritin in extract of traditional chinese medicine sijunzi decoction by High-performance liquid chromatography［J］.J Chin Pharm Sci，2005，14（4）:227-330.

［6］何三民，石森林.HPLC法测定甘草中甘草素、异甘草素、甘草苷的含量［J］.中草药，2003，34（7）:618-619.

［7］付玉杰，祖元刚，刘晓娜，等.酸水解法提取甘草中异甘草素工艺研究［J］.中国药学杂志，2007，42（11）:818-820.

［8］崔淑芬，张信青，许柏球，等.高效液相色谱法同时测定甘草中甘草酸和甘草苷的含量［J］.时珍国医国药，2006，17（3）:307-308.