肾病综合征大鼠肾组织中肿瘤坏死因子α的变化及霉酚酸酯对其影响

韩丹，姜红

（中国医科大学 附属第一医院儿科，沈阳 110001）

原发性肾病综合征（primary nephrotic syndrome，PSN）是最为常见的小儿肾小球疾病之一。肾病综合征的发病机制至今仍不清楚，近年研究证明，肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factar-α，TNF-α）可能参与PSN发病［1］，监测血清TNF-α水平有助于判定病情和预后［2］。然而目前有关PSN肾脏组织中TNF-α变化的报道很少。PSN治疗虽然仍以糖皮质激素为主，并使大部分患者得以缓解，但复发、频复发、激素依赖、激素耐药等问题仍然是临床治疗的难题。霉酚酸酯（mycophenolate mofetil，MMF）是一种新型免疫抑制剂，近年已逐渐用于难治性肾病的治疗，并被证实安全有效［3，4］，但是 MMF 治疗 PSN 的机制仍不十分清楚。

本研究通过构建大鼠肾病综合征模型，讨论肾组织中TNF-α与PSN的关系，观察MMF对大鼠肾病综合征的实验室指标、肾脏组织学及肾组织中TNF-α变化的影响，为MMF用于人类PSN的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：健康雄性纯种Wistar大鼠36只，SPF清洁级，周龄 6～8周，体质量 170～210 g，购至中国医科大学实验动物中心。

1.1.2 用药及试剂：盐酸阿霉素（意大利法玛西亚普强公司）、霉酚酸酯（上海罗氏制药有限公司）、肿瘤坏死因子α免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）、SABC试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）、DAB显色剂（福州迈新生物技术开发有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及给药方法：将36只Wistar大鼠随机分3组：肾病综合征组（A组）、酶酚酸酯干预组（B组）、正常对照组（C组），每组各12只。其中A、B均制成肾病综合征模型，B组从实验第1天给予MMF干预，剂量按20 mg/kg，每日1次，灌胃，共28 d，A组、C组从第1天给予0.4 ml生理盐水，每日1次，灌胃，共 28 d。

1.2.2 肾病综合征模型的建立：于实验第1天，A组和B组按Bertain方法［5］制作肾病综合征模型，即非麻醉下一次性尾静脉注阿霉素（6.5 mg/kg），C组同法注射等量生理盐水。

1.2.3 观察指标：将大鼠于实验 1、7、14、21、28 d 置于代谢笼中，收集24 h尿液，测24 h尿蛋白定量。各实验组于实验14、21、28 d分别处死4只，取出双肾，切成小块以2.5%戊二醛或4%多聚甲醛固定，以备切片进行光镜、TNF-α免疫组化检测及电镜检查。

1.2.4 免疫组化结果的判定：细胞质呈棕黄色着染的为阳性细胞。TNF-α表达的强度用MetaMorph offline图像分析系统测定，每张切片在高倍（×400）下测定5个视野的平均积分光密度值（integral optical density，IOD），取其平均值表示。

1.3 统计学分析

计量资料以x±s表示，利用SPSS13.0软件,采用单因素方差分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 24 h尿蛋白定量

实验14 d之后，A组和B组大鼠24 h尿蛋白定量显著高于C组（P<0.01），造模成功；A组24 h尿蛋白定量逐渐增多；B组24 h尿蛋白定量均显著低于A组（P<0.01），实验21 h达高峰，28 d与21 d相比明显下降。见表1。

表1 各组24 h尿蛋白定量水平的比较（x±s）Tab.1 24-hour urine protein quantity of each group（x ±s）

2.2 光镜

实验28 d各组肾小球和肾小管均未见明显变化。本实验A、B组光镜表现符合微小病变型肾病。见图1。

2.3 电镜

实验28 d，A组大鼠肾脏均出现肾小球上皮细胞肿胀、空泡形成、广泛足突融合；而B组大鼠肾脏也出现肾小球上皮细胞肿胀、空泡形成，但仅部分足突出现融合；C组肾小球上皮细胞正常。见图2。

2.4 免疫组化

TNF-α主要表达于肾小管细胞胞质中，肾小球细胞胞质中也有少量表达，阳性产物呈棕黄色颗粒。在实验 14、21、28 d，A 组大鼠肾脏中 TNF-α 的表达均显著强于B组、C组（P<0.01），并随实验的进行表达显著增加；而B组TNF-α的表达均弱于A组（P<0.01），强于 C 组（P<0.01），并在实验 21 d达高峰；C组TNF-α在肾脏组织中表达较少，各个时期强度不变。见表2，图3。

表2 各组大鼠肾组织中TNF-α表达的IOD的变化（x±s）Tab.2 The average integrate OD value changes of TNF-α in rat renal tissues（x ±s）

3 讨论

小儿PNS发病机制，现认为与淋巴细胞功能紊乱有关，炎性细胞因子在肾病综合征的发生、发展中起重要作用［6］。TNF-α 主要由激活的单核/巨噬细胞、T淋巴细胞所产生，肾脏固有细胞，如系膜细胞、内皮细胞、肾小管上皮细胞也能产生。TNF-α具有多向性生物活性，可造成炎性损伤［7］，TNF-α 可促进许多分子的表达，如IL-8等，这些生物分子会使系膜细胞和内皮细胞通透性增加。

本研究通过构建大鼠肾病综合征模型，讨论肾组织中TNF-α与原发性肾病综合征发病的关系，实验中A组TNF-α在肾脏组织中随着病程表达逐渐增多，与C组相比表达显著增强。说明了肾组织中TNF-α可能参与原发性肾病综合征发病。

糖皮质激素及细胞毒性药物虽然可使大部分患者得以缓解，但由于对人体细胞的选择性差，在抑制异常的免疫反应同时，也抑制人体其他细胞的正常功能，因此毒副作用大。MMF是一种新型免疫抑制剂，其特点是选择性地抑制鸟嘌呤的经典合成途径［8］，对淋巴细胞增殖的抑制具有高度的选择性，而对肝细胞、骨骼细胞等其他细胞无影响，MMF已逐渐用于难治性肾病的治疗。

本实验证实了MMF可缓解原发性肾病综合征病情。实验中B组TNF-α在肾脏组织中表达弱于A组，略强于C组，并随干预的进行在实验21 d后减弱。说明了MMF治疗肾病综合征的机制可能与肾组织中TNF-α水平的减少有关。

综上所述，大鼠肾病综合征模型肾组织中的TNF-α增高。MMF可能通过降低肾组织中TNF-α的增高，减少蛋白尿，减轻肾组织的损伤。

［1］Rizk MK，El-Nawawy A，Abdel-Kareem E，et al.Serum interleukins and urinary microglobulin in children with idiopathic nephrotic syndrome［J］.East Mediterr Health J，2005，11（5-6）：993-1002.

［2］Pogan A，Sancewicz-Pach K，Miezyński W.TNF-alpha and soluble interleukin-2 receptor and glomerular sclerosis in primary nephrotic syndromein children［J］.Wiad Lek，2005，58（Suppl1）：39-44.

［3］Paydas S，Kurt C，Taskapan H，et al.The effect of mycophenolate mofetil on primary and secondary treatment of primary glomeru－lonephritisand lupusnephritis［J］.Int Urol Nephrol，2009，41（1）：145-152.

［4］Gellermann J，Querfeld U.Frequently relapsing nephritic syndrome：treatmentwithmycophenolatemofeil［J］.Pediatr Nephrol，2004，19（1）：101-104.

［5］Bertain T，Andreina P，Bid D，et al.Adriamycin-induced nephrotic syndromein rat［J］.Lab Invest，1982，46：16.

［6］Tripathi G，Jafar T，Mandal K，et al.Does cytokine gene polymorphism affect steroid responses in idiopathic nephrotic syndrome?［J］.Indian JMed Sci，2008，62（10）：383-391.

［7］Laflam PF，Garin EH.Effect of tumor necrosis factor alpha and vascularpermeabilitygrowthfactoronalbuminuriainrats［J］.PediatrNephrol，2006，21（2）：177-181.

［8］Ulinski T，Aoun B.Pediatric idiopathic nephrotic syndrome：treatment strategies in steroid dependent and steroid resistant forms［J］.Curr Med Chem，2010，17（9）：847-853.