HPLC法测定眼保Ⅱ号胶囊中大黄酚的含量

张培琴

（贵阳中医学院第一附属医院，贵阳市 550001）

眼保Ⅱ号胶囊是我院老中医经过几十年临床经验，根据中医药学理论研制而成的纯中药复方制剂，由决明子、丹参、山药、茯苓等15味中药组成，具有清肝养肝、滋肾明目之功效，主要用于近视、视疲劳、眼底血管病变、眼底视网膜病变的治疗。目前，其质量标准仅有常规胶囊剂检查项目和薄层色谱定性鉴别，未对处方中主要有效成分建立质量控制项目。决明子为方中君药，性味甘、苦、咸、微寒，归肝、大肠经，始载于《神农本草经》，具有清热明目、润肠通便之效，主治目赤涩痛、羞明多泪、头痛眩晕、目暗不明、大便秘结。多年来，国、内外学者在决明子的化学成分方面做了大量研究，发现决明子中含蒽醌类、萘骈吡喃酮类、脂肪酸类、氨基酸和无机元素等，主要成分为蒽醌类，其中大黄酚为主要有效成分[1]。因此，笔者以2005年版《中国药典》（一部）决明子的含量测定方法为依据[2]，对眼保Ⅱ号胶囊中决明子的主要有效成分——大黄酚进行了含量测定。

1 材料

1.1 仪器

1100型高效液相色谱（HPLC）仪，包括四元泵、自动进样器、VWD检测器、柱温箱、1100化学工作站（美国Agilent公司）；AB265-S型电子分析天平（瑞士Metler Toledo公司）；KQ-200KDB型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

大黄酚对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110769-200514）；眼保Ⅱ号胶囊（本院自制，规格：每粒0.44 g，批号：080701、080805、080909、080923、081125）；决明子药材（贵州贵阳济仁堂中药饮片厂，批号：20080402）；甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent C18（150 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：无水甲醇-0.1%磷酸溶液（87∶13），用前以0.45µm微孔滤膜滤过；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：254 nm；柱温：25 ℃。理论塔板数按大黄酚计算应不低于3000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取大黄酚对照品适量，加无水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）制成浓度约20 µg·mL-1的溶液，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 取样品约5.0 g，精密称定，置具塞瓶中，加甲醇50 mL，精密吸取，称重，加热回流30 min，放冷，再称重，用甲醇补足失重，摇匀，滤过，精密吸取续滤液25 mL，置烧瓶中，挥去甲醇，残渣加10%盐酸溶液30 mL，水浴中加热水解1 h，放冷后以三氯甲烷强力振摇萃取4次，每次30 mL，合并三氯甲烷液并回收至干，残渣置10 mL量瓶中，用无水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。用前以0.45µm微孔滤膜滤过。

2.2.3 阴性对照溶液 取不含决明子的处方药材，根据眼保Ⅱ号胶囊生产工艺制备不含决明子的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.2.4 决明子药材溶液 取决明子药材，干燥，粉碎，过5号筛，取药粉约0.5 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备决明子药材溶液。

2.3 系统适用性试验

精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液、决明子药材溶液各10µL，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果，供试品色谱中指标成分与相邻峰分离度为5.17，理论塔板数以决明子峰计算＞3000；阴性对照在大黄酚峰位置处无峰出现，表明本法专属性好。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.大黄酚对照品；B.供试品；C.决明子药材；D.阴性对照Fig 1 HPLC chromatogramsA.chrysophanol control；B.test sample；C.C.obtusifolia；D.negative control

2.4 线性关系考察

精密吸取大黄酚对照品溶液2、4、6、8、10、12、14、16 µL，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，对照品进样量（X）为横坐标，制备标准曲线，得回归方程为Y＝4798.63X－2.79（r＝0.9999）。结果表明，大黄酚进样量在0.0426～0.3408µg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.5 稳定性试验

取同一供试品溶液，室温下放置，按“2.1”项下色谱条件分别在0、1、2、4、8、12、24 h各进样10 µL，测定。结果，平均峰面积为794.93，RSD＝1.11%，表明供试品溶液在室温放置24 h内稳定。

2.6 精密度试验

精密吸取对照品溶液10µL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，连续测定6次。结果，平均峰面积为811.38，RSD＝0.26%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

取同一批眼保Ⅱ号胶囊内容物适量，共6份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10µL，按“2.1”项下色谱条件测定。结果，样品平均含量为0.034 mg·g-1，RSD＝1.33%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的样品，分别精密加入一定量的大黄酚对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10µL，按“2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.9 样品含量测定

分别取5个批号眼保Ⅱ号胶囊内容物适量，共3份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10µL，按“2.1”项下色谱条件测定样品中大黄酚的含量。结果，5批样品中大黄酚的平均含量分别为0.027、0.034、0.025、0.030、0.023 mg·g-1，RSD分别为2.4%、2.0%、1.9%、2.2%、1.6%。

3 讨论

本试验考察了样品提取方法（回流提取与超声提取）、水解时间及流动相的比例。结果表明，回流30 min，水解60 min，以无水甲醇-0.1%磷酸溶液（87：13）为流动相为最佳方案。

笔者曾参考有关决明子及其复方制剂的含量测定方法[3～5]用于本制剂的测定，但其结果均不理想。后采用文中方法，简便、灵敏、准确、重复性好，可用于眼保Ⅱ号胶囊的质量控制。本试验所得5批样品含量测定结果相差较大，可能与决明子产地不同有关[6]。

[1]郝延军，桑育黎，赵余庆.决明子的研究进展[J].中草药，2001，32（9）：858.

[2]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：98.

[3]鲍银童，金 纯，刘长宝，等.HPLC测定金氏痔疮膏中大黄素和大黄酚含量[J].中成药，2005，27（11）：1358.

[4]郑 妍，李晓珍，高 宏.HPLC法测定柔脉颗粒中大黄酚的含量[J].中国新医药，2003，2（10）：20.

[5]鄢海燕，邹纯才，方洪壮.决明子生品及炮制品的HPLC指纹特征研究[J].中国药房，2009，20（30）：204.

[6]刘 芳，陈建伟.HPLC测定炒决明子中总大黄酚的含量[J].中成药，2005，27（5）：549.