HPLC法测定不同产地鬼臼类药材中鬼臼毒素的含量

赵祖兴，杨光义，陈吉炎，叶方，郝新才

（1.湖北中医学院药学院，武汉市 430061；2.郧阳医学院附属太和医院，十堰市 442000）

在我国，鬼臼类药材包括小檗科鬼臼亚科Dysosma versipellis（Hance.）M.Cheng Podophylloideae桃儿七属 Sinopodophyllum、山荷叶属Diphylleia、八角莲属Dysosma等3个属，各属代表药用植物分别有桃儿七S.hexandrum（S.emodi（Wall.ex Royle）Ying）、南方山荷叶D.sinensis H.L.Li以及八角莲D.versipellis（Hance）M.Cheng。鬼臼类药材主要以干燥根茎入药[1]。主要成分鬼臼毒素为芳基四氢萘类木质素，具有抗肿瘤、抗病毒等活性[2]，以及祛风除湿、活血止痛、镇咳平喘等功能[3]。鬼臼类药材因其多种植物来源而导致异名繁多、品种混用现象比较严重，屡有因用法用量问题而引发中毒事件[4]。鬼臼毒素为其主要毒性成分，不同产地药材中鬼臼毒素含量差异较大，鬼臼类药材饮片中毒剂量从几克到几十克不等[5]。为了比较不同产地鬼臼类药材的毒性大小，本试验用高效液相色谱（HPLC）法测定不同产地鬼臼类药材中鬼臼毒素的含量，以为临床安全合理用药提供依据。

1 仪器与试药

Ultimate 3000型HPLC仪，包括四元梯度泵、自动进样器、紫外检测器（美国戴安公司）；Chromeleon软件数据处理系统。

甲醇为色谱纯，水为纯化水，氯仿、磷酸二氢钾为分析纯；鬼臼毒素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111645-200301）；鬼臼类药材分别采于湖北、重庆、云南等地，由郧阳医学院药学系生药教研室陈吉炎教授提供并鉴定为真品。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

精密称取各样品粉末（过2号筛）1 g，置于250 mL锥形瓶中，加氯仿50 mL，回流提取1 h，过滤，滤液挥干，残渣用甲醇溶解，定容于50 mL容量瓶中，备用。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取在五氧化二磷干燥器中减压干燥12 h的鬼臼毒素对照品10 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。

2.3 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），前加预柱（10 mm×4.6 mm）；检测波长：290 nm；柱温：30℃；流动相：甲醇-0.1 mol·L-1磷酸二氢钾（45∶55）；流速：1.0 mL·min-1。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图A.鬼臼毒素对照品；B.供试品Fig 1 HPLC chromatogramsA.podophyllotoxin control；B.test sample

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察：精密量取鬼臼毒素对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按“2.3”项下色谱条件测定峰面积。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，鬼臼毒素含量（X）为横坐标，制备标准曲线，得回归方程为Y＝85.2859X+1.6881（r＝0.9998）。结果表明，鬼臼毒素的进样量在0.156～1.3 mg·mL-1的范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.4.2 精密度试验：精密吸取鬼臼毒素对照品溶液10 μL，重复进样5次，测定。结果，RSD＝0.0026%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验：取供试品溶液，分别于配制后0、2、5、8、10 h进样。结果，RSD＝0.0114%（n＝5），表明供试品溶液在10 h内检测对结果无影响，稳定性良好。

2.4.4 重复性试验：按“2.5”项下方法操作，对同一样品重复测定6次，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL。结果，RSD＝0.42%，表明方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验：精密称取已测含量的样品，分别精密加入低、中、高浓度的对照品，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定。结果，其平均回收率为100.06%，RSD＝1.99%，说明该测定方法可行。加样回收率试验结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.5 样品含量测定

精密量取对照品溶液及供试品溶液各10 μL进样，以外标一点法计算鬼臼毒素含量。药材样品来源、编号及鬼臼毒素含量测定结果见表2。

3 讨论

10批样品的测定结果表明，鬼臼毒素含量最多的依次是产地湖北竹溪的南方山荷叶、产地重庆的南方山荷叶、产地云南的南方山荷叶，含量最少的是产地湖北房县的六角莲。

不同产地、不同品种的鬼臼类药材所含鬼臼毒素差异较大，故用生药材入药时，各种药材的中毒剂量也有差异。

[1]马绍宾，胡志浩.小檗科鬼臼亚科的地理分布与系统发育[J].云南植物研究，1997，19（1）：48.

[2]尚明英，徐珞珊，李 萍，等.鬼臼类中药及其木脂素类成分的药效学研究[J].中草药，2002，33（8）：722.

[3]肖培根编.新编中药志（第1卷）[M].北京：化学工业出版社，2002：1.

[4]张三全，曾 抗，李国峰，等.动物实验对脂质体鬼臼毒素外用的安全性观察[J].临床皮肤科杂志，2003，32（4）：188.

[5]杨光义，杜士明，黄良永，等.鬼臼类中药毒理学研究进展[J].中国药房，2008，19（36）：2872.