可注射5-氟尿嘧啶缓释凝胶体外释放及其大鼠体内药动学研究

郝堂娜，李镇，乔明曦，范青，黄俊梓，陈大为#（.大连医科大学附属第二医院药剂科，大连市 607；.大连医科大学药学院，大连市 607；.沈阳药科大学药学院，沈阳市 006）

近年来，环境敏感水凝胶作为一种智能高分子材料在设计和制备自调式给药系统中扮演了重要角色。一般来讲，此类物质的合成主要以生物可降解性聚酯为原料，通过调节嵌段组成比例或加入符合要求的新嵌段来调控其物理、化学性质，以控制药物释放速率、释放部位等，达到不同的设计要求[1，2]。pH/温度双重敏感共聚物磺胺甲嘧啶低聚物/聚-ε-己内酯-丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物（OSM1-PCLA-PEG-PCLAOSM1）作为智能给药系统的一种优良载体，是在温度敏感嵌段共聚物聚-ε-己内酯-丙交酯/聚乙二醇（PCLA-PEG-PCLA）的基础上引入pH敏感单体磺胺甲嘧啶低聚物（OSM1），使其具备pH、温度双重敏感的性质，克服了单纯温敏型聚合物注射过程中易堵塞、不适宜深层病变部位给药等缺点，可以更灵敏地感知人体生理环境的变化[3]。

5-氟尿嘧啶（5-FU）自1957年由Heidelberg公司开发问世以来，在临床上得到了广泛的应用，主要适用于各种消化道癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌等的治疗，在常见的恶性肿瘤如结肠癌、皮肤癌及乳腺癌，尤其是胃肠道肿瘤的治疗中，至今尚无其它药物可以代替[4]。因其脂溶性小，口服难吸收，个体差异大，静脉给药后血药浓度迅速下降，t1/2仅为10～20 min，而且毒副作用较大，故其在临床应用中存在一定的局限性。因此开发和研制5-FU缓、控释及靶向制剂已成为抗肿瘤药物研究领域的热点之一。与传统的微粒制剂相比，缓释凝胶作为药物缓、控释给药系统显示出较大的优势，尤其是以生物可降解高分子材料制备的缓释凝胶，具有生物相容性好，毒副作用小，缓、控释效果明显，药效维持持久等特点。笔者以pH/温度双敏生物可降解共聚物OSM1-PCLA-PEG-PCLA-OSM1为载体材料，制备了可注射5-FU缓释凝胶。该制剂在室温（25℃）、pH 8.0环境中以溶液形式存在，注入体内后，随着体内环境（37℃，pH 7.4）的变化刺激产生应答，形成凝胶，发挥缓释作用。本文即对该制剂的体外释放和体内药动学规律进行了初步的研究与探讨。

1 材料

1.1 仪器

LC-10AD高效液相色谱仪、SPD-10A型紫外检测器（日本岛津株式会社）；HW2000色谱工作站（南京千谱软件有限公司）；ZRD6-B型药物溶出仪（上海黄海药检仪器厂）；TGL-16C型台式离心机（上海菲洽尔分析仪器有限公司）；XW-80A涡旋混合器（上海精科实业有限公司）；微量进样器（上海安亭微量进样器厂）。

1.2 试药

5-FU（沈阳药科大学制药厂，批号：990605，含量：≥90.0%）；磺胺甲嘧啶（SM1，美国 Sigma公司，批号：55-46826-100 mg，含量：≥99.0%）；聚乙二醇（PEG 2000，上海浦东高南化工厂）；丙交酯（LA，北京康安高分子开发中心）；己内酯（ε-CL，上海浩深贸易有限公司）；偶氮二异丁腈（AIBN，上海第四试剂厂）；N，N-二甲基甲酰胺（DMF，天津市博迪化工有限公司）；3-巯基丙酸（MPA，美国Alfa Aesar公司）；4-二甲基氨基吡啶（4-DMAP，上海市嘉辰化工有限公司）；二环己基碳二亚胺（DCC，上海延长生化科技发展有限公司）；甲醇（色谱纯，天津康科德科技有限公司）；对氨基苯甲酸（PABA，常州盛华化工有限公司）；磷酸二氢钾（KH2PO4，广东汕头市西陇化工厂）；其余试剂均为市售分析纯。

1.3 动物

Wistar大鼠，♂，体质量140～150 g，购自沈阳药科大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK（辽）2003-008。给药前禁食12 h，实验期间自由饮水、进食。

2 方法

2.1 嵌段共聚物OSM1-PCLA-PEG-PCLA-OSM1的合成[5]

将SM1经酰化反应得到酰化产物（Sulfamerazine monomer，SM1M），以MPA为链延长剂，AIBN为链引发剂，采用自由基聚合法，合成OSM1。采用开环聚合法合成温度敏感共聚物PCLA-PEG-PCLA，按一定摩尔比称取上述2种合成产物适量，以DMF为溶剂，在偶联剂4-DMAP和脱水剂DCC的作用下，经脱水缩合反应，得到嵌段共聚物OSM1-PCLA-PEGPCLA-OSM1。

2.2 可注射5-FU缓释凝胶的制备

5-FU亲水性较强，采用物理混合法制备缓释凝胶。称取5-FU原料药和共聚物OSM1-PCLA-PEG-PCLA-OSM1适量，置于装有磁力搅拌子的西林瓶中，加溶剂磷酸盐缓冲液（PBS，pH 8.0）适量，室温（25℃）下搅拌溶解，使5-FU与共聚物溶解形成的胶束溶液充分平衡，即得5-FU共聚物溶液。

2.3 可注射5-FU缓释凝胶体外释放考察

取5-FU载药量为0.5%、共聚物浓度为15%、20%和25%（W/W），共聚物浓度为25%、5-FU载药量为0.2%、0.5%、1%（W/W）的凝胶溶液各1 mL，置于5 mL具塞玻璃试管中（释放面积为0.50 cm2），每份样品平行取3份。将试管放入溶出仪中，水浴温度为37℃，待溶液完全形成凝胶后，向5-FU凝胶试管中加入3 mL释放介质（含有0.02%NaN3的pH 7.4的PBS）。调节溶出仪转速为50 r·min－1，在预定的时间取出全部释放介质，同时加入同体积的新鲜释放介质以保证漏槽条件。释药时间为9 d。将取出的含药释放介质经0.45µm微孔滤膜过滤、流动相稀释适当倍数后，取20 μL注入液相色谱仪进行测定，并计算累积释放百分率。（1）色谱条件。色谱柱：Welch极限柱XB-C18（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：甲醇-水＝5∶95（V/V）；流速：1.0 mL·min－1；柱温：室温；检测波长：265 nm；进样量：20 μL。（2）方法学考察结果。5-FU检测浓度线性范围为20～100 μg·mL－1（r＝0.9997）；低、中、高浓度样品加样回收率分别为100.27%、100.78%、100.24%；日内RSD分别为0.61%、0.39%、0.28%；日间RSD分别为0.92%、1.85%、0.86%。

2.4 大鼠体内血药浓度测定

（1）色谱条件。色谱柱：Phenonenex-C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：甲醇-20mmol·L－1KH2PO4水溶液＝5∶95（V/V），加入0.01%的三乙胺后调节pH至5.5；流速：0.8 mL·min－1；柱温：室温；检测波长：265 nm；进样量：20 μL。（2）生物样品处理。在5 mL离心管中加入0.5 mg·mL－1的内标PABA 20 μL，氮气吹干。精密移取血浆0.2 mL置于离心管中，涡旋振荡1 min，加入2 mL乙酸乙酯，涡旋振荡5 min后，离心5 min（4000 r·min－1）。分离移取1.5 mL有机层至另一个1.5 mL尖底离心管中，40℃水浴中氮气吹干，所得富集物以100 μL流动相溶解，涡旋1 min，离心5 min（10000 r·min－1），取上清液20 μ L注入液相色谱仪进行测定。（3）方法学考察结果。5-FU血浆检测浓度线性范围为0.5～60 μg·mL－1（r＝0.9983）；低、中、高浓度血浆样品方法回收率分别为76.62%、86.71%、97.37%；萃取回收率分别为80.59%、76.94%、89.46%；日内RSD分别为2.86%、2.78%、2.74%；日间RSD分别为1.96%、2.69%、0.74%。

2.5 5-FU缓释凝胶大鼠体内药动学考察

（1）注射用药液制备。参比制剂组为自制5-FU溶液剂，浓度为10 mg·mL－1；受试制剂组为5-FU缓释凝胶，浓度为10 mg·mL－1；（2）给药方案与样品采集。将12只大鼠随机分为2组，分别以每只10 mg的剂量皮下注射5-FU溶液和缓释凝胶。受试制剂组于给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、9、12、24、48、72 h，由眼眶后静脉丛取血约0.5 mL，置于事先涂有肝素的离心试管中，离心10 min（3500 r·min－1），取上层血浆，于－20 ℃冰箱中保存。参比制剂组于给药后0.083、0.25、0.5、1、2 h，按上述操作分离血浆保存。采用“2.4”项下方法测定各组不同时间血药浓度。

3 结果

3.1 药物体外释放结果

5-FU在共聚物浓度分别为15%、20%和25%的缓释凝胶中释药曲线如图1所示。

图1 共聚物浓度对5-FU体外释放的影响Fig 1 Effect of copolymers concentrations on in vitro release of 5-FU

图1结果表明，5-FU在共聚物浓度为15%、20%、25%的缓释凝胶中第9天时平均累积释放百分率分别为89.66%、87.59%、80.85%。

5-FU在载药量分别为0.2%、0.5%、1%的缓释凝胶中释药曲线如图2所示。

图2 载药量对5-FU体外释放的影响Fig 2 Effect of drug-loading rate on in vitro release of 5-FU

图2结果表明，5-FU在载药量为0.2%、0.5%、1%的缓释凝胶中第9天的平均累积释放百分率分别为75.30%、80.85%、86.90%。

3.2 5-FU体外释放模型拟合

5-FU在整个释药过程中释药速率均较快，将共聚物浓度为25%、载药量为0.2%的缓释凝胶中5-FU累积释放百分率对时间分别进行零级动力学方程、一级动力学方程、Higuchi动力学方程和Ritger-peppas动力学方程拟合[6]，结果见表1。

表1 5-FU体外释放模型拟合Tab 1 In vitro release model fitting of 5-FU

由表1可以看出，5-FU的释放曲线采用Higuchi动力学方程拟合优度相对较好，表明该制剂是以扩散控制型为主的释药模式。

3.3 体内药动学

根据各时间点血药浓度数据绘制的参比制剂组、受试制剂组的平均药-时曲线见图3。

图3 皮下注射2种制剂后平均血药浓度-时间曲线A.参比制剂；B.受试制剂Fig 3 Mean plasma concentration-time curves of 5-FU after subcutaneous injection of two preparationsA.reference preparation；B.test preparation

采用统计矩非隔室动力学理论对实验所得的药动数据进行处理，其中达峰时间tmax和达峰浓度Cmax由原始实验数据直接得出。以药-时曲线尾部4个血药浓度数据点的对数对时间进行线性回归，直线的斜率即消除速度常数Ke（h－1），t1/2可由公式t1/2＝0.693/Ke求得，AUC（0～t），AUC（0～∞）根据梯形法计算，计算结果见表2。

表2 皮下注射2种制剂后药动学参数比较Tab 2 Comparison of pharmacokinetic parameters of 5-FU after subcutaneous injection of two preparations

由表2中各参数可知，与参比制剂组相比，受试制剂组tmax有所延后，Cmax明显下降，t1/2延长，AUC值明显增加。

4 讨论

4.1 体外释放条件的选择

对于可注射缓、控释给药系统而言，影响药物从注射部位（皮下、肌内、病变部位等）吸收的主要因素有：注射部位血流或淋巴流量；药物的亲脂性及颗粒溶解速度；药物与载体贮库的结合度；注射部位药物贮库的性状和表面积等。本文所设计的共聚物OSM1-PCLA-PEG-PCLA-OSM1载药水凝胶主要将其用于皮下或肿瘤部位注射。皮下环境血流量较少，注射部位药物释放速率主要由药物从制剂中的释放来控制，而不是由药物吸收入血流的速率来控制。当凝胶在体内形成药物贮库后，药物的释放依赖于以下因素：贮库中药物的总量；药物溶出的有效面积；药物载体的性质及药物的理化性质。因此笔者分别考察了共聚物载体浓度和载药量对5-FU释放的影响。在选择体外释放条件时，主要针对注射部位的生理条件，选用37℃、pH 7.4作为体外释放条件。

4.2 共聚物浓度对药物释放的影响

从不同共聚物浓度药物释放曲线可以看出，释放初期药物的释放速率与共聚物的浓度基本无关；随后释放速率随共聚物浓度的增加略微降低。药物包载在共聚物凝胶中，存在于不同的空间位置，部分分布在共聚物凝胶内部深层区域，部分吸附在共聚物凝胶表层区域，释放初期主要表现为吸附在表层的药物释放，因此释放速率无明显区别。随后主要表现为凝胶内部药物的释放，增加共聚物的浓度，溶液中胶束的数量随之增加，进而形成的凝胶结构中胶束的数量也增加，胶束间距离缩短，深层区域药物分子通过胶束间的扩散速率受密集胶束产生的空间位阻影响较大，扩散速率随之降低，表现为释药速率降低[7]。5-FU体外释药均无明显的突释效应，主要是由于共聚物溶液在形成凝胶以后进行药物释放考察，胶面表层面积较小，表面吸附药量较少，不足以造成突释效应。

4.3 载药量对药物释放的影响

由不同载药量的药物释放曲线可知，释放初期药物的释药速率均随着载药量的增加明显加快。原因在于载药量越大，凝胶表层吸附的药物越多，释放较快。释放中期，随着载药量的增加，药物释放速率增大。当5-FU载药量逐渐增大时，分布在亲水区域的药物分子数目增多，其极易通过凝胶的亲水性通道扩散出去。而释药后期，亲水区域过饱和状态的药物大部分通过扩散方式释放完全，余下包裹在共聚物胶束中的药物主要通过共聚物的溶蚀、降解释放，载药量对释药速率无明显影响。

4.4 药动学结果比较

由表2中各参数可知，5-FU溶液组血药浓度短时间达到峰值，随后血药浓度迅速下降，说明5-FU在体内代谢迅速。而5-FU缓释凝胶组经皮下注射给药后，与5-FU溶液组相比，tmax有所延后，Cmax明显下降；从t1/2和AUC来看，缓释凝胶组明显大于溶液组，且体内滞留时间延长，充分显示了5-FU缓释凝胶制剂皮下注射后具有良好的缓释作用。

本文成功合成了pH/温度双重敏感共聚物OSM1-PCLAPEG-PCLA-OSM1，与单纯温敏型共聚物相比，可以更灵敏地感知人体生理环境的变化。利用该载体材料制备了水溶性药物5-FU可注射缓释凝胶，并对该制剂的体外释放规律及体内药动学进行了初步的研究和探讨。实验结果表明，与普通水溶液组相比，5-FU缓释凝胶皮下注射后具有良好的缓释效果，有望制备成供临床应用的缓释制剂。

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