RGB叶绿素仪测量数据回归方法

何明霞，张素娟，李进才，李 萌，张 旭

(1. 天津大学精密测试技术及仪器国家重点实验室，天津 300072；

2. 天津大学农业与生物工程学院，天津 300072)

叶绿素是植物吸收光能进行光合作用的物质基础，叶片的叶绿素含量与植物光合速率、营养状况等密切相关[1-2]．实时、快速、非破坏性的便携式叶绿素仪，在植物生理研究和营养诊断等方面有一定的应用价值[3-5]．日本、美国、英国等对便携式叶绿素仪进行了研究开发．日本研制的便携式叶绿素仪 SPAD502在我国得到了广泛应用[6-8]．其工作原理是以波长940,nm的红外光作透射参照，检测波长650,nm红光的吸光度[9]．目前我国对叶绿素仪的开与国外存在一定差距，因此，开发研制了用于检测植物叶片对红光(R)、绿光(G)、蓝光(B)吸光度的便携式RGB叶绿素仪[10]．并且，为了使 RGB叶绿素仪测量值准确反映叶绿素含量，根据朗伯-比耳定律(Lambert-Beer law)和吸光度的加和性，建立了 RGB频率的对数值与叶绿素含量的回归数学模型[11-14]．通过对绿色程度不同的彩纸、黄瓜叶片的检测对回归模型进行了验证，为RGB叶绿素仪植物叶片叶绿素含量检测奠定了一定的应用基础．

1 RGB测量数据处理的理论基础

1.1 朗伯-比耳定律和吸光度加和性

所研制开发的便携式 RGB叶绿素仪以白光LED作测试光源，包括 LED光源模块、RGB颜色传感器模块、LCD液晶显示模块和数据存储器模块[10]，如图 1所示．利用该仪器获得植物叶片的透射光的红光(R)、绿光(G)、蓝光(B)吸光度值，并由朗伯-比耳定律和吸光度的加和性，建立回归数学模型，得到植物叶片的叶绿素含量．

图1 叶绿素仪系统示意Fig.1 Block diagram of chlorophyll meter

朗伯-比耳定律：有色溶液对光的吸收程度与溶液的浓度、液层的厚度及入射光的波长有关，如果入射光的波长不变，光吸收的程度就只与溶液的浓度和液层厚度有关，数学表达式为

式中：A为吸光度；I0为入射光强度；It为透射光强度；T为透光率；K为一定温度下吸光物质在特定波长和特定溶剂的特征常数；b为液层厚度；c为溶液浓度．有色溶液是朗伯-比耳定律适用条件，但此定律也可用于叶片叶绿素含量的测量．所研制的 RGB叶绿素仪测量原理与日本研制的叶绿素仪SPAD502都是以朗伯-比耳定律为理论基础的．

吸光度的加和性：如果溶液中有数种吸光物质，此混合液在某一波长下的吸光度等于各组分在该波长下吸光度的总和，数学表达式为

1.2 RGB数据的朗伯-比耳处理与加和性处理

RGB叶绿素仪测试白光穿过植物叶片时，R、G、B三种光光强会发生衰减，衰减的一部分由叶绿素吸收引起，另一部分由叶片中其他物质的吸收或遮挡引起，其他因素引起的衰减可看成是由一种特殊浓度吸光物质引起的，根据朗伯-比耳定律和吸光度加和性建立RGB叶绿素仪测量值与叶绿素含量的关系有

式中：R0为发射红光强度；Rt为透射红光强度；KR为红光与叶绿素间比例常数；Kxr为红光与特殊吸光物质间比例常数；G0为发射绿光强度；Gt为透射绿光强度；KG为绿光与叶绿素间比例常数；Kxg为绿光与特殊吸光物质间比例常数；B0为发射蓝光强度；Bt为透射蓝光强度；KB为蓝光与叶绿素间比例常数；Kxy为蓝光与特殊吸光物质间比例常数；b为叶片厚度；c为叶绿素浓度；cx为特殊吸光物质浓度．将式(3)、式(4)和式(5)加权相加，则得

朗伯-比耳定律成立条件为单色光，RGB叶绿素仪测试光是非单色光，在非单色光条件下朗伯-比耳定律会产生偏离[11]，因此，需要对式(6)进行修正，得

修正后，RGB叶绿素仪测量值与植物叶片叶绿素含量间关系为式(7)．为验证式(7)的有效性，对绿色程度不同的彩纸进行了检测．绿色彩纸的稳定性相对叶片更好，且彩纸颜色变化量与变化范围可以控制，是一种理想的试验材料．由于叶绿素含量值与 SPAD值线性相关[6]，式(7)可写为

2 RGB叶绿素仪用于彩纸和黄瓜叶片测试试验

2.1 RGB叶绿素仪彩纸测试试验

以 17张绿色程度不同的彩纸为检测对象，每张彩纸分别用 RGB叶绿素仪和 SPAD502仪进行多点测量并求其平均值，根据 RGB对数值与 SPAD值进行多元线性回归分析[15]得到方程

线性相关系数r＝1.000，大于置信度0.01时的相关系数 0.721，回归方程极显著，说明 RGB对数值与SPAD值间线性关系是真实的，式(7)得到初步验证．SPAD502仪测得的SPAD值为实测SPAD值，将彩纸实测 RGB值代入式(9)，得到预测 SPAD值，在图2中分别用横坐标x与纵坐标y表示．图2中直线表示x＝y的理想值曲线．

图2 实测SPAD值与预测SPAD值关系(r＝1.000)Fig.2 Relationship between measured SPAD values and/predicted SPAD values(r＝1.000)

2.2 RGB叶绿素仪黄瓜叶片测试实验

2.2.1 黄瓜叶片测试方法

为进一步验证式(8)的实用性，将RGB叶绿素仪用于黄瓜叶片的检测．首先，对一组黄瓜叶片测量，建立了RGB对数值与黄瓜叶片叶绿素含量的多元线性回归方程．然后，用另一组黄瓜叶片测量值检测回归方程的有效性．最后，将 RGB叶绿素仪测量效果与SPAD502测量效果进行比较．

第1组黄瓜叶片为21片，第2组为19片．每片叶为一样本，各样本分别用RGB叶绿素仪、SPAD502和分光光度计进行测量，获得每片叶的对应的 RGB值、SPAD值、叶绿素含量．利用打孔器在每片叶上取8小片子样品(顶部、中上部、中下部、底部各取 2小片)，用于 RGB仪、SPAD仪的测量，每片叶子样品的RGB值、SPAD值为8个样品RGB值、SPAD值的平均值，分别用 Rt、Gt、Bt、SPAD 表示．再用分光光度计进行每片叶子叶绿素含量的测定，测量值定义为用实测叶绿素含量．

2.2.2 黄瓜叶片RGB测量数据分析

利用第1组黄瓜叶片的实测叶绿素含量与RGB值，通过 Matlab数据处理工具，对式(8)进行线性回归，建立了 RGB对数值与叶绿素含量的多元线性回归方程，叶绿素含量用Y表示，得到

将第2组黄瓜叶片的RGB仪测得值代入回归方程(10)，得到叶绿素含量的预测值 Y．图 3(a)与图3(b)分别表示实测叶绿素含量与 2组黄瓜叶片预测叶绿素含量的关系，图中直线表示实测叶绿素含量值等于预测叶绿素含量时的理想状态．

分析图3(a)曲线预测值与实测值的相关系数r＝0.755，大于置信度0.01时的相关系数0.665．图3(b)曲线的预测值与实测值的相关系数为 r＝0.727，大于置信度 0.01时的相关系数 0.691，仍为极显著．由此可以说明，建立的回归方程(10)的有效性，以及 RGB叶绿素仪测量黄瓜叶片叶绿素含量模型回归方程(8)的实用性．

2.2.3 黄瓜叶片 SPAD502测量数据分析及与 RGB测量数据比较

利用第 1组黄瓜叶片的实测叶绿素含量与SPAD502测得的SPAD值，通过Matlab数据处理工具，对式(8)进行线性回归，建立SPAD值与叶绿素含量间线性回归方程，叶绿素含量用Y表示，得到方程为

将第 2组黄瓜叶片的 SPAD值代入回归方程(11)，得到叶绿素含量的预测值Y．图4(a)与图4(b)分别表示实测叶绿素含量与 2组黄瓜叶片预测叶绿素含量的关系，图中直线表示实测叶绿素含量值等于预测叶绿素含量时的理想状态．

图3 实测叶绿素含量与RGB仪预测叶绿素含量关系Fig.3 Relationship between measured chlorophyll content,and predicted RGB ones

图4 实测叶绿素含量与SPAD预测叶绿素含量关系Fig.4 Relationship between measured chlorophyll content,and predicted SPAD ones

分析图 4(a)和(b)，其预测值与实测值的相关系数分别为0.880和0.755．大于置信度0.01时的相关系数 0.691，仍为极显著．由此可以说明，建立的回归方程(11)的有效性，以及 RGB叶绿素仪测量黄瓜叶片叶绿素含量模型回归方程(8)的实用性．

比较图 3(a)和图 4(a)曲线的的相关系数，分别是 0.755和 0.880，即 RGB叶绿素仪和 SPAD502仪测量值比较，可以得出：SPAD502仪测得的 SPAD值与叶绿素含量值之间的线性度，要好于 RGB叶绿素仪．比较第 2组黄瓜叶片测量值，即图 3(b)和图4(b)曲线的的相关系数分别为 0.727和 0.702，RGB叶绿素仪在测量重复性好于SPAD502仪．表明RGB叶绿素仪对植物叶片叶绿素的含量的测量，有其独特的优越性．

3 结 语

根据朗伯-比耳定律和吸光度加和性，分析并建立了RGB叶绿素仪测量数据处理模型——多元线性方程，并利用绿色程度不同的彩纸进行试验，初步证实该测量方法的有效性．通过对黄瓜叶片进行测量，得到了RGB叶绿素仪黄瓜叶片叶绿素含量测量关系式，并用 SPAD502仪对黄瓜叶片叶绿素含量进行测量，比较了 RGB叶绿素仪、SPAD502对黄瓜叶片叶绿素含量测量效果，证明了 RGB叶绿素仪测量方法的实用性．此外，RGB叶绿素仪比 SPAD502仪包含更多的光强信息，可用于植物叶片与其他生物中某物质含量的测量，如红发夫酵母中虾青素含量的测量．

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