枯草芽孢杆菌所产细菌素的理化性质及抑菌谱的研究

徐海燕，张志焱，曹银生，李美丽，谷 巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东 泰安 271000）

近年来，由于抗生素的滥用，在食品中抗生素、药物残留及防腐剂添加超标而导致的出口损失，已成为畜牧业发展的瓶颈。人们迫切需要探寻一种能取代抗生素的抗菌剂，于是细菌素成为近年来研究的热点。

细菌素是细菌代谢过程产生的蛋白质或多肽，具有抑制某些微生物生长活性的作用[1-2]。细菌素是一种蛋白类物质，可以被蛋白酶所降解，具有无抗药性、无残留、能够抑制或杀死某些致病菌等优点[3-4]。

枯草芽孢杆菌作为公认的益生菌，其产生的细菌素在养殖业和畜牧业中作为绿色饲料添加剂使用有着巨大的开发潜力。为此，本文初步分析了枯草芽孢杆菌Nxc6所产细菌素的理化性质及其抑菌谱，以期为该细菌素在养殖业和其他领域的开发应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株

枯草芽孢杆菌Nxc6由山东宝来利来生物研究院从牛粪中分离，经数次传代，抗菌活性稳定。

指示菌：大肠杆菌O1、金黄色葡萄球菌等，由山东宝来利来生物工程股份有限公司生物研究院保存。

1.2 培养基

细菌指示菌培养基：葡萄糖0.5%、蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、氯化钠0.5%、进口琼脂1.5%、pH 7.0。

真菌指示菌培养基：PDA培养基。

枯草芽孢杆菌Nxc6种子培养基：肉汤培养基。

枯草芽孢杆菌Nxc6发酵培养基：葡萄糖0.5%、蛋白胨1%、牛肉膏0.3%、pH 6.5。

1.3 芽孢杆菌发酵液的制备

从枯草芽孢杆菌Nxc6斜面上挑取一环至液体种子培养基中，37℃振荡培养24 h，然后以1%的接种量接种到发酵培养基中，置500 mL三角瓶中，装液量为100mL，37℃振荡培养30 h，得到发酵液，待用。

1.4 产细菌素的鉴定

将发酵液3 000 rpm离心15 min，去除菌体得上清液，首先测定上清液中pH的变化，排除酸的影响，采用过氧化氢酶法进行过氧化氢的检测，以排除过氧化氢的干扰。然后缓慢的向上清液中加入终质量分数为60%的硫酸铵进行盐析，4℃放置12 h使蛋白质充分沉淀，5 000 rpm离心20 min，弃上清，将沉淀溶于原体积1/10的蒸馏水中，制成抗菌液，进行抗菌活性的测定。

1.5 最佳硫酸铵浓度的选择

将培养好的发酵液于3 000 rpm离心15min去除菌体，上清液倒入8个250mL三角瓶中，每瓶100 mL，边搅拌边缓慢加入经过研磨的无水硫酸铵粉末，使溶液的最终质量分数分别达到10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，4℃放置8～12 h，使蛋白沉淀出来，13 500 rpm离心10min，弃上清，用蒸馏水将沉淀复溶，倒入透析袋中进行流水透析（过夜）；分别测定8个浓度的上清液和透析液的抗菌活性，根据抑菌圈的大小确定硫酸铵的最佳质量分数。

1.6 细菌素抗菌活性的检测

细菌素抗菌活性的检测采用牛津杯法。双碟的制备：取直径90 mm的培养皿，注入灭菌的营养琼脂（1.5%）15mL，水平放置使之凝固，作为底层，取指示菌培养基（浓度为0.8%，冷却至50℃）与指示菌菌液适量混匀，取6 mL铺在底层培养基上，水平放置使之凝固，作为菌层。

用无菌镊子夹取已灭菌的牛津杯，打开皿盖，放在培养基上。在牛津杯中加满相同量的抗菌液（300μL），每个样品3个重复。将加完样的培养皿小心放入37℃恒温箱内，培养18 h后（其中以真菌做指示菌的培养时间为30℃、3 d）取出测量抑菌圈直径。

1.7 枯草芽孢杆菌Nxc6抗菌蛋白粗提液的性质研究

温度稳定性：分别取5mL透析液于9支试管中，在20、40、60、80和100℃ 下处理 10、30和60min，冷却后检测其抗菌活性。

pH的稳定性：分别取5 mL透析液于8支试管中，用 4mol·L－1的盐酸或 4mol·L－1的氢氧化钠溶液将发酵上清液pH调至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，室温下保持24 h后将各管的pH调回7.5，检测其抗菌活性。

蛋白酶稳定性：将透析液分别与胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶以及胃蛋白酶混合，使酶的终浓度为0.5 mg·mL－1，在各种酶的最适温度、最适pH下作用2 h，反应结束后将混合液的pH调回7.5，检测其抗菌活性。

1.8 抑菌谱的测定

抗细菌活性试验采用牛津杯法，同1.6。

孢子悬液的制备：向培养好的真菌斜面上注入5 mL无菌生理盐水，洗下孢子制成菌悬液（含107孢子·mL－1）。双碟的制备以及加样品同1.6，其中菌层指示菌为真菌孢子悬液。

2 结果

2.1 产细菌素的鉴定

微生物发酵后能够产生多种抗菌物质，如：脂肪酸、氨等，枯草芽孢杆菌Nxc6经发酵后，其发酵液的pH为7.5，故可排除酸碱抗菌的影响，并且其上清液有明显的抑菌活性。其上清液经硫酸铵沉淀后表现出更加明显的抗菌活性，见表1。

因此，可以认为枯草芽孢杆菌Nxc6所表现出来的抗菌活性主要是蛋白类物质，即细菌素类物质。

表1 产细菌素的鉴定mm

2.2 最佳硫酸铵质量分数的确定

不同硫酸铵质量分数沉淀结果（以抑菌圈直径表示）见表2。

表2 不同硫酸铵质量分数沉淀结果 mm

从表2可以看出，硫酸铵的质量分数在20%～40%时，透析液的抑菌活性处于较高的平台期，这一阶段是比较稳定的，并且硫酸铵质量分数为30%时上清液的抑菌活性处于较低的水平，说明细菌素的分离是比较完全的。虽然质量分数为70%时硫酸铵沉淀出的细菌素与硫酸铵质量分数为30%沉淀产生的细菌素的抗菌活性大体相同，但是进一步增加硫酸铵的浓度，只能析出杂蛋白，对抗菌活性无显著的影响，因此硫酸铵沉淀的最终质量分数为30%。

2.3 枯草芽孢杆菌Nxc6抗菌蛋白粗提液的性质研究

2.3.1 温度稳定性

不同温度和处理时间对细菌素活性的影响结果见图1。

图1 不同温度和处理时间对细菌素活性的影响

从图1可以看出，枯草芽孢杆菌Nxc6所产生的细菌素具有良好的热稳定性。对金黄色葡萄球菌而言，在20、40、60、100℃处理30min，活性基本没什么变化，只是在80℃处理60min时，活性出现了小幅的下降。对大肠杆菌而言，在20、40、60、100℃处理10min，活性没有较大的波动，只是在80℃处理30～60 min时，活性出现了小幅的下降。枯草芽孢杆菌Nxc6所产细菌素的这种热稳定性为其工业化生产和应用提供了理论依据。

2.3.2 pH的稳定性

不同pH对细菌素活性的影响结果见图2。

图2 不同pH对细菌素活性的影响

从图2可以看出，对金黄色葡萄球菌而言，pH为10.0～11.0时的抗菌活性下降较为明显，但仍保持在较高的水平；对大肠杆菌O1而言，pH为11.0时的抗菌活性稍有下降。可见枯草芽孢杆菌Nxc6产生的细菌素在弱酸、中性以及碱性环境中有很好的稳定性。

2.3.3 蛋白酶稳定性

蛋白酶对抗菌物质活性的影响结果见图3。

图3 蛋白酶对抗菌物质活性的影响

从图3可以看出，枯草芽孢杆菌Nxc6发酵上清液经过几种蛋白酶处理后，抗菌活性明显降低，但仍具有一定的活性，尤其是对胰蛋白酶最为敏感，这一结果表明了该细菌素是蛋白类物质。

2.4 细菌素的抑菌谱测定

2.4.1 细菌素对各种细菌的抑菌谱

细菌素对各种细菌的抑菌谱结果见表3。由表3可知，该细菌素对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有明显的抑制作用，表明其是一种比较广谱抗菌的细菌素。

表3 细菌素对各种细菌的抑制作用 mm

2.4.2 细菌素对各种真菌的抑菌谱

细菌素对各种细菌的抑制作用结果见表4。

由表4可知，该细菌素对部分真菌有较强的抑制作用，而对部分真菌则无抑制作用。

表4 细菌素对各种细菌的抑制作用mm

3 结论

研究表明，枯草芽孢杆菌Nxc6所产细菌素具有较强的抑菌效果，且具有很好的热稳定性、酸碱稳定性，在pH为8.0时抑菌活性最大，胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶以及胃蛋白酶均可使该细菌素部分失活。

枯草芽孢杆菌Nxc6所产细菌素的抑菌谱较宽，对畜牧业及食品污染中常见的致病微生物金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及对引起农作物患病的腐败菌（如白叶枯病菌）有明显的抑制作用，因此枯草芽孢杆菌Nxc6所产细菌素在畜牧业、养殖业以及食品、农业等领域中具有一定的应用价值。

[1]李平兰,张篪,江汉湖.细菌素研究慨述[J].中国畜产与食品,1998,5（2）:82-84.

[2]Torkar K G,Matijasic B B.Partial characteri-sation of bacteriocins produced by bacilluscereus isolates from milk and milk products[J].Food Technol Biotechnol,2003,41（2）:121-129.

[3]刘焕利,潘小玫,张学君,等.产抗菌蛋白芽孢杆菌的筛选及抗菌蛋白性质[J].中国生物防治,1995,11（2）:160-164.

[4]周冰,张惟材.枯草芽孢杆菌蛋白质分泌机制研究进展[J].生物技术通讯,2004,15（3）:281-285.