酶联免疫吸附试验在药残检测中的不足及解决方法

郭淑萍，徐周乔

（深圳市盐田区动物卫生监督所，广东深圳 518081）

食品安全问题已经成为全球关注的焦点问题之一。近年来,兽药残留致使食物中毒的报道屡见报端,严重损害了人们的健康，而且造成了意想不到的经济损失和巨大的政治影响。传统的检测方法主要采用高压液相色谱（HPLC）、气相色谱一质谱法（GC－MS）等分析法检测兽药残留，需要昂贵的仪器设备和专业人员，费时、费力、成本高，难以在基层推广。酶联免疫吸附试验（ELISA）具有操作简便、灵敏度高、样品容量大、仪器化程度和分析成本低的优点，已成为目前畜产品药物残留检测中使用最普遍的方法之一，几乎所有重要的畜产品药残检测都已建立或试图建立ELISA，如“瘦肉精”、莱克多巴胺、磺胺类、沙丁胺醇等。尽管酶联免疫吸附试验有操作简便的优点，但在实践中很容易出现各种各样的问题，影响因素较多，易出现假阳性结果等缺点。现将常出现问题的可能原因和解决方法以及影响因素作如下探讨。

一、酶联免疫吸附试验原理

ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

二、常出现问题的可能原因及解决方法

目前酶联免疫法检测用试剂盒种类繁多，有国外进口的，有国内自行研制生产的，如盐酸克仑特罗的检测用试剂盒就有德国拜尔、美国IDS、英国朗道、北京望尔、杭州迪恩等。如何在众多的品牌中选择既能满足检测要求又价格低廉的试剂盒是一个问题。在实际检测中可以根据最低检测限、回收率、交叉反应率。标准曲线图谱及数据，进行选择。一般进口试剂盒性能稳定性比国内试剂盒好。但不管进口或者国内试剂盒难免会造成假阴性或假阳性，常出现问题的可能原因及解决方法有其共性。

1.显色结束仍没有颜色或吸光度值偏低。出现这种情况的可能的原因主要有几个方面，一是试剂盒保存运输不当；二是使用前酶标板已完全干燥；三是酶标抗原未加或稀释度过低或加错；四是温度过低或试剂盒没有回温；五是检测试剂盒中的酶标抗原失效；六是试剂盒超过有效期。

解决方法：试剂盒在运转过程中，要放在加冰袋的保温盒中，尽量缩短运输时间，实验室保存试剂盒放在4℃～8℃冰箱中存放，不可放在室内。使用前检查酶标板，将已干孔丢弃；酶标抗原必须严格按照说明书中酶标抗原的稀释倍数进行稀释并准确加样；酶标抗原失效可与供应商联系，进行更换；在接收试剂时要验明有效期，如试剂盒有效期太短，不能在有效期内用完则要求供货商换货。

2.显色结束整块板吸光度值都很高。出现这种情况有两方面原因，一是酶标抗原污染了盒内的其他试剂，二是未进行洗版操作，直接加显色剂。此种情况可以更换新批号试剂盒，并严格按照说明书中的洗板操作步骤进行稀释。

3.标准曲线形态不好，吸光度值偏高。主要是酶标抗原的稀释倍数偏低，反应温度过高。抗原稀释时必须按照说明书稀释倍数进行稀释，反应温度在控制合理范围内。

4.标准曲线形态不好，吸光度值偏低。主要是因为加酶标抗原前未进行洗板操作，酶标抗原的稀释倍数偏高，反应温度过低。同样要严格按照洗版步骤和抗原稀释倍数操作，控制反应温度。

5.平行性不好。主要是加样及试剂量不准确，洗版后孔干燥时间过长，酶标抗原加入时有误差。要求定期校准移液器，移液器与移液头要配套，使其吻合紧密，确保准确加入足量标本和试剂。操作时务必保持实验的连贯性，试验的保温温度、时间要一致，洗涤要彻底，不要手工洗板与洗板机洗板互换。酶标抗原稀释前注意混合均匀，使用多道移液器进行加入操作。

6.样品的高阳性率。主要是样品处理去脂肪或蛋白不彻底，实验时样品要按要求进行前处理。

7.样品的吸光度值高于零标准孔。引起的因素主要是样品中蛋白或脂肪含量、pH值、离子强度等。如果严格按照操作方法进行操作，此现象应作为阴性处理。

8.回收率不理想。如果样品浑浊，添加标准时浓度低，添加体积大都会造成回收率不理想。做添加回收实验时要选感觉明亮的本底，添加少量高浓度标准品。

9.整板均不显色。整板均不显色，包括阳性对照孔也不显色。有下列3种情况。

（1）制造商工艺流程出现问题，如包被过程中抗原或抗体未固相化在载体上。

（2）试剂盒保存不当，或运输过程中温度过高，使酶蛋白变性，失去生物活性。

（3）更常见的原因是，试剂配制有误，或操作不当所致。如终止液误当洗涤液稀释后当洗涤液使用，终止液误作底物配制液配制底物。操作过程中，未加酶标抗体或抗原和未加显色液而误认为已加入。

对整板均不显色，首先应核实是何种原因引起。要求配制试剂时仔细认真，严格按照说明书进行操作。此问题是可以完全避免的。

10.整板均显色。出现整板均显色的实验室结果，主要有以下几种原因。

（1）水质被重金属离子污染。

（2）洗涤不充分，残留酶标抗原或抗体，或样品中存在其他干扰成分，未被洗掉。

（3）酶标抗原或抗体加量过多，使按规程洗涤仍达不到洗涤目的。

（4）移液头重复使用而未清洗干净。解决上述问题的措施是，使用新鲜蒸馏水或去离子水配制试剂；试验前校准移液器，准确加入酶标抗原或抗体的量；充分洗涤，不使酶标记物由于洗涤不充分而残留；移液头尽可能一次性使用，否则就要对其彻底清洗后再用。另外，对整板均显色要特别注意二点，一是虽然整板均显色，但阳性对照孔比平时显色更深；二是阳性对照孔本应不显色而显色，这对查找整板均显色的原因很有帮助。

三、实验室影响因素

除在实验过程出现的问题，实验室整个环境过程都会影响到检验结果，主要有以下几个因素。

1.实验室操作人员的素质因素。实验室人员应具备一个良好的思想素质，有一定文化素质和技术素质，能熟练掌握本专业的基本理论和基本技术，认真学习新理论新知识，努力提高自己的业务水平，创造一个能够胜任本职工作的技术平台。在工作中，有条不紊、冷静沉着的处理有关事务。

2.样本处理因素。实验室人员收到样本后应认真查对，对不符合检测要求的要退回，合格标本要及时进行处理检测。对不能及时检测的标本要妥善保存于4℃冰箱，贴好待检标签，做好记录。从冰箱取出的标本要预温至室温，对冰冻的样品要融化好，并充分混匀再用。

3.操作过程的影响因素。

（1）操作前应对实验的物理参数有充分的了解，如环境温度(保持在18℃～25℃)、反应孵育温度和孵育时间、洗涤的次数等，要先查看水育箱温度，是否符合要求。

（2）正确使用加样器。加样器应垂直加入标本或试剂，避免刮擦包被板底部。加样过程中避免液体外溅，残留在反应孔壁上，加样器吸头要清洗干净，避免污染，加样次序要与说明书一致，否则可导致结果错误，实验重复性差。

（3）手工洗板加洗液时冲击力不要太大，洗涤次数不要超过说明书推荐的洗涤次数，洗液在反应孔内滞留的时间不宜太长。不要使洗液在孔间窜流，造成孔间污染，导致假阴性或假阳性。

（4）要保证加液量一致。

（5）显色液量不可过多。加样的工作环境不能处于阳光直射的环境下，加显色系统后要避光反应，显色液量不能过多，以免显色过强。

4.试剂的影响因素。应选用有质量保证试剂盒。试剂应妥善保存于4℃冰箱内，在使用时先平衡至室温，不同批号的试剂组分不宜交叉使用。试剂开启后要在一周内用完，剩余的试剂下次用时应先检查是否变质，显色剂如被污染变色将造成全部显色，导致错误结果。过期的试剂不宜再用，若别无选择，应做好双份质控品的监测，确保结果的可靠性。

5.采取措施，避免差错事故的发生。创造一个良好的工作环境，建立完善的质量保证体系，将质控贯穿到整个实验过程，包括待检者的准备、标本的采集与处理、操作过程、检验结果的审核、结果的登记与保存、报告单的发放等一系列的制度，用制度管人，明确责任，错误的结果还是能够避免发生的。

综上所述，在使有用ELISA试验中，会由于各种情况影响试验结果。但只要按说明书规范操作，规范实验程序，出现问题后仔细分析，认真查找其中原因，并加以有效地防范和解决，就能得到准确的试验结果。为遏制兽药残留提供可靠的实验依据。