结核分枝杆菌抗原MPT51及其临床应用研究进展

彭 超,王洪海

(1复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验室,上海200433; 2江西中医学院基础医学院)

结核分枝杆菌抗原MPT51及其临床应用研究进展

彭 超1,2,王洪海13

(1复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验室,上海200433; 2江西中医学院基础医学院)

结核分枝杆菌;MPT51蛋白

近年来,结核病的发病率有升高趋势,是人体免疫缺陷病毒(H I V)感染患者的主要死因。结核病的病原菌主要为结核分枝杆菌,随着多耐药结核分枝杆菌和H I V共感染的发生率增加,迫切需要研制新的疫苗和抗结核药物以及可靠的早期诊断方法。结核分枝杆菌能分泌大量不同种类的免疫原性蛋白,其中MPT51/MPB51是主要分泌性蛋白之一,能结合纤维结合素;亦是结核病诊断和疫苗的候选蛋白之一。现对MPT51的基础研究概况及其应用进展综述如下。

1 MPT51的结构组成及特性

1.1 MPT51基因 MPT51基因由mpt51基因编码、900个碱基组成,其核苷酸已被克隆。MPT51基因密码子邻近Ag85A,但不属于同一个操纵子。mpt51基因有自己的启动区,位于fbpA的下游区,且与Ag85复合物有40%同源性。卡介苗(BCG)中的MPB51是BCG培养滤液中主要的分泌蛋白之一,由mpb51基因编码。mpb51基因位于Ag85A下游,距离179 bp,编码299个氨基酸,其中33个氨基酸是信号肽,266个氨基酸是相对分子质量为27 807.37 Da的成熟蛋白。MPB51与Ag85复合体有37%～43%的同源性,二者有2个同源性很强的区域,代表保守的功能域,位于氨基酸端的22PYENLMVPSPS MGRD IPVAFLAGGPHAV2YLLD233和内部区域的1892NNTRVWV2195。189～195区域同时亦是MPB51最输水区域、Ag85复合物组成部分和FN结合位点。

1.2 MPT51蛋白 MPT51蛋白相对分子质量为27 kD,是结核分枝杆菌在生长过程中分泌至细胞外的主要蛋白之一,约占细胞外蛋白的15%。其在胞质溶胶和细胞表面以三聚体形式存在[1],与Ag85复合物有交叉反应,属于同一个分泌蛋白家族。在培养滤液中MPT51和Ag85复合物比例是1∶3,二者既有相同又有不同的抗原决定基,在结核杆菌细胞中发挥不同作用。

MPT51蛋白的晶体结构分辨率为1.7!,与Ag85复合物中的Ag85B和Ag85C一样,折叠成α/β水解酶。但MPT51蛋白不含有分支酰基转移酶的催化三联体(Ser2His2 Glu),且缺少α,α′2海藻糖单霉菌酸酯结合位点和活性位点,因此MPT51蛋白无分支酰基转移酶的功能。MPT51蛋白可能是一类新的非催化性的α/β水解酶,其结构类似于某些整合素与糖结合蛋白,因此MPT51蛋白可能在宿主组织黏附上有一定作用,其配体可能包括了血清蛋白纤维结合素(FN,存在于血浆和组织中的相对高分子质量糖蛋白,在细胞发育、能动性、粘连、吞噬作用和损伤修复、炎症反应等方面起重要作用)和小分子糖。Xolalpa等[2]研究发现, MPT51蛋白具有结合和激活人的纤溶酶原产生纤维蛋白溶酶(可直接降解细胞外基质和基底膜如层粘连蛋白和纤维结合素,并间接活化基质金属蛋白酶和弹性蛋白酶)的作用,此可能与结核分枝杆菌的侵入散播和造成组织损伤有关。

2 MPT51的临床应用

2.1 MPT51在结核病诊断中的应用 MPT51是结核诊断的潜在生物标识物。Ramalingam等报道,MPT51对175例治疗前痰涂片和培养阳性结核患者诊断中的敏感性和特异性分别为71%和95%。Bethunaickan等[6]研究发现,痰涂片和培养阳性结核患者的血清抗MPT51的IgG、IgA和Ig M敏感率分别为57%、47%和13%,IgG特异性为98%;IgG+IgA敏感性为71%,特异性为95%;在痰涂片阴性而培养阳性患者中,IgG阳性率为34%;在痰涂片和培养阴性,X射线阳性患者中,IgG阳性率为42%。

Ramalingam等[7]研究发现,MPT51免疫检测在H I V21阳性患者结核早期诊断中有重要作用。Singh等[8]用临床结核症状出现前几个月H IV结核共感染患者的血清分析了结核分枝杆菌培养滤液蛋白对于亚临床诊断的作用,约有12个抗原被上述血清所识别。其中MPT51和苹果酸合酶(MS)能被90%的H IV结核共感染患者血清识别。表明MPT51可用于H IV阳性结核病高危人群的诊断。Wanchu等[9]研究发现,痰涂片阳性的H IV-TB+和H IV+TB+患者的敏感性约达80%,特异性>97%。表明MPT51和MS可作为发病初期亚临床结核患者的诊断标识物。

当MPT51蛋白与其他抗原性蛋白结合用于诊断时可提高其敏感性和特异性。MPT51和GlcB能被80%印度人的H IV阴性痰涂片阳性结核患者的血清抗体所识别。Achkar等[10]研究表明,MPT51和GlcB结合的血清学诊断可辅助痰涂片镜检作为肺结核快速诊断方法。Melo Cardoso等[11]报道,重组蛋白MPT51和GlcB对结核病患者血清学诊断的敏感性、特异性分别为75.5%、90.8%。Raja等[12]的实验分析了结核分泌蛋白38 kD、30 kD及MPT51、胞质蛋白16 kD的血清学诊断作用。结果显示MPT51检测结核血清的敏感性和特异性均很高,特别是当MPT51、38 kD、30 kD和胞质蛋白16 kD蛋白结合诊断时,敏感性和特异性分别为91%和96%。

2.2 MPT51在结核病疫苗研制中的应用 基因疫苗是疫苗研制的第三次革命。MPT51能结合细胞外基质的FN,在宿主组织附着和毒力方面有重要作用。Ana Paula Junqueira2Kipnis小组研究发现,感染了结核杆菌的BALB/c小鼠脾脏和肺部的MPT51特异性IFN 2γ+T淋巴细胞数量有所增加;对未感染结核杆菌的BALB/c小鼠接种 rMPT51/F IA和 rMPT51/CpGD2 NA疫苗能增加IFN 2γ+T淋巴细胞的数量;接种 rMPT51/F IA后能诱导MPT51特异性的体液反应;接种60 d后,肺组织中结核杆菌的菌落(CFU)数量减少了2个log。表明MPT51是具有潜力的DNA疫苗[13]。Yukio Koide小组还研究了编码巨噬细胞炎症蛋白(M IP21α)和MPT51的DNA疫苗对于诱导特异性T淋巴细胞的作用。发现编码融合蛋白的DNA疫苗较仅编码MPT51的DNA疫苗能显著诱导小鼠产生更多的抗原特异性T细胞。编码M IP21α抗原的融合蛋白DNA疫苗能通过趋化因子受体有效递呈给抗原递呈细胞,并诱导更高水平的抗原特异性T淋巴细胞反应[14]。

由于单核细胞增生李斯特氏菌(L.M.)能在专职抗原递呈细胞(如巨噬细胞和树突状细胞)内逃离吞噬溶酶体,在细胞质中存活并繁殖,还可诱导Th1型免疫反应,因此可将外源性抗原的DNA引入L.M.构建重组L.M.活疫苗。Yukio Koide小组构建了携带Ag85A、Ag85B、MPB/MPT51真核表达质粒的自毁型L.M.,用该细菌重组体感染可诱导这些基因在小鼠巨噬细胞株J774A.1中的表达。C57BL/6小鼠腹膜内免疫此细菌重组体能诱导PPD特异性的细胞免疫反应如脚跟反应、脾细胞增殖反应、脾细胞IFN γ2的分泌等,显示出此细菌重组体抗结核感染的效果。另有研究发现,静脉免疫此重组疫苗的BALB/c小鼠免疫保护反应强于BCG。Yukio Koide小组还用慢性病毒作为载体。研究了MPT51作为疫苗的作用,结果发现气管内免疫改良后携带MPT51基因的第三代慢性病毒疫苗2周后,能诱导纵膈淋巴结产生MPT51特异的T细胞。此疫苗在肺部能产生MPT51特异性记忆细胞,但在淋巴结中不能。此外,MPT51慢性病毒疫苗气管内免疫能显著降低结核杆菌在肺部的数量。

综上所述,MPT51是结核分枝杆菌主要的分泌蛋白和重要保护性抗原之一,在结核病诊断和新型疫苗研制方面具有重要价值。

[1]Al2sayyed B,Piperdi S,Yuan X,et al.Monoclonal antibodies to Mycobacterium tuberculosis CDC 1551 reveal subcellular localiza2 tion ofMPT51[J].Tuberculosis,2007(87):4892497.

[2]Xolalpa W,Vallecillo AJ,Lara M,et al.Identification of novel bacterial plas minogen2binding proteins in the human pathogen My2 cobacterium tuberculosis[J].Proteomics,2007(7):333223341.

[3]SuzukiM,Aoshi T,Nagata T,et al.Identification ofmurine H22 Dd2and H22Ab2restricted T2cell epitopes on a novel protective an2 tigen,MPT51,ofMycobacterium tuberculosis[J].Infect I mmun, 2004,72(7):382923837.

[4]Aoshi T,SuzukiM,UchijimaM,et al.Expression mapping using a retroviral vector forT cell epitopes:definition of a Myco2 bacterium tuberculosispeptide presented byH22Dd[J].J I mmunol Methods,2005,(298):21234.

[5]Aoshi T,Nagata T,SuzukiM,et al.Identification of an HLA2A3 02012restricted T2cell epitope on the MPT51 protein,a major se2 creted protein derived fromMycobacterium tuberculosis,byMPT51 overlapping peptide screening[J].Infect I mmun,2008,76(4): 156521571.

[6]Bethunaickan R,Baulard AR,Locht C,et al.Antibody response in pulmonary tuberculosis against recombinant 27kDa(MPT51, Rv3803c)protein ofMycobacterium tuberculosis[J].Scand J In2 fectDis,2007,39(10):8672874.

[7]Ramalingam B,Uma Devi KR,Raja A.Isotype2specific anti238 and 27 kDa(mpt 51)response in pulmonary tuberculosiswith hu2 man immunodeficiency virus coinfection[J].Scand J Infect Dis, 2003,(35):2342239.

[8]Singh KK,Dong Y,Belisle JT,et al.Antigens ofMycobacterium tuberculosis recognized by antibodies during incipient,subclinical tuberculosis[J].Clin Diagn Lab I mmunol,2005,12(2):3542 358.

[9]WanchuA,Dong Y,Sethi S,et al.Biomarkers for clinical and in2 cipient tuberculosis:perfor mance in a TB2endemic country[J]. PLoSOne,2008,3(4):e2071.

[10]Achkar JM,Dong YX,Holzman RS,et al.Mycobacterium tuber2 culosismalate synthase2and MPT512based serodiagnostic assay as an adjunct to rapid identification of pulmonary tuberculosis[J]. Clin Vaccine I mmunol,2006,13(11):129121293.

[11]Melo Cardoso Almeida C,Vasconcelos AC Jr,Kipnis A,et al. Humoral immune responses of tuberculosis patients in Brazil indi2 cate recognition of Mycobacterium tuberculosis MPT251 and GlcB [J].Clin Vaccine I mmunol,2008,15(3):5792581.

[12]Raja A,Ranganathan UD,Bethunaickan R.I mproved diagnosis of pulmonary tuberculosis by detection of antibodies against multiple Mycobacterium tuberculosis antigens[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2008,(60):3612368.

[13]Silva BD,da Silva EB,do Nascimento IP,et al.MPT251/CpG DNA vaccine protects mice against Mycobacteriumtuberculosis [J].Vaccine,2009,(27):440224407.

[14]Uchijima M,Nagata T,Koide Y.Chemokine receptor2mediated delivery of mycobacterial MPT51 protein efficiently induces anti2 gen2specific T2cell responses[J].Vaccine,2008,(26):51652 5169.

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国家十一五重大传染病专项资助项目(2008ZX10003005)。

3通讯作者