VEGF-Notch/Delta级联信号通路对脑缺血后血管新生的影响

王 荣，李长生

（1.山东中医药大学临床学院，山东 济南 250014； 2.山东省千佛山医院中医科，山东 济南 250014）

血管新生（angiogenesis）是指从原有的血管上生出新的毛细血管，包括内皮细胞增殖、迁移、细胞间黏附、排成直线及形成开放的腔样结构，此过程还包括血管基底膜及细胞外基质的降解。脑缺血时，血管新生对神经系统的成型及保护具有重要的作用，它不仅可为损伤组织提供必要的营养支持，还可以使炎性细胞浸润，促进损伤组织的清除，在一定程度上减少神经功能的缺失［1］。脑缺血时，血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作为最重要的血管生成因素之一，表达增加，促使血管形成。Notch/Delta信号通路是广泛存在于脊椎和非脊椎动物的重要信号传导通路，对血管的发生发展有重要调控功能。本文拟从血管新生过程、VEGF和Notch/Delta信号通路二者的相互作用方面做一总结。

1 VEGF的结构及其生物活性

VEGF是 1989年由 Ferrara N等［2］在牛垂体滤泡星形胶质细胞的培养液中分离出的一种可扩散的内皮细胞特异性的分裂原，后来发现与1983年报道的在肿瘤细胞系培养液中发现的一种能影响肿瘤微血管通透性的蛋白，即血管通透因子（vascular permability factor，VPF）同属一物。血管内皮细胞生长因子是最重要的血管生成因素之一，正常脑组织中只有少量VEGF表达。缺血缺氧时，VEGF表达显著增加，通过与其受体的相互作用调控内皮细胞分化、增殖和血管形成［3］。

1.1 VEGF家族及其受体

VEGF是由二硫键连接而成的二聚体糖蛋白，相对分子量为34 kDa～45 kDa，其编码基因位于染色体6q21.3，长约14 kb，由8个外显子和7个内含子交替构成。VEGF家族现发现5个成员：VEGF-A（即通常所指的 VEGF）、VEGF-B、VEGF-C、VEGFD以及胎盘生长因子。人类VEGF由于基因剪切方式的不同可形成多种多肽产物，主要有VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189 和 VEGF206， 其中VEGF165在细胞中含量最丰富，大脑中尤以VEGF165最多。

目前比较肯定的VEGF受体主要有3种：①Fam样酪氨酸激酶受体（Fam-like tyrosine kinase receptor，Flt-1/VEGFR-1），主要与内皮细胞的形态发生及调节有关；②激酶插入域或胎肝激酶受体（kinase insert domain-containing receptor/fetal liver kinase，KDR/Flk-1/VEGFR-2），主要调节内皮细胞及神经细胞的分裂、增殖及血管通透；③VEGFR-3/Flt-4，激活该受体主要引起淋巴管内皮细胞增生［4］。VEGF主要通过VEGFR-1与VEGFR-2在内皮细胞上发挥作用，其中VEGFR-2为发挥作用的主导受体，可与所有形式的VEGF相互作用，是诱导内皮细胞增殖分化的主要介质［5］，VEGF直接的神经营养和神经保护作用也与VEGFR-2有关。Jin K L等［6］的实验证实，VEGF可减少体外模拟脑缺血环境培养的NH33神经细胞系死亡，在缺氧和无葡萄糖状态培养下，VEGF可使NH33细胞存活数量增加1倍。Western blot检测发现此时NH33细胞中可检测出VEGFR-2和nertopilin-1表达，而没有VEGFR-1表达。同样条件下加入nertopilin-1配体胎盘生长因子，发现其并不具备类似VEGF的神经保护作用，所以推测VEGF神经保护作用位点是VEGFR-2。

1.2 VEGF表达的调控

VEGF基因表达受多种因素调控，缺氧是最有力的诱导因素。VEGF基因的启动子区含有缺氧诱导因子-1 （hypoxia inducible factor-1，HIF-1） 反应元件，缺氧/低氧时，HIF-1可与VEGF基因5′端低氧反应元件结合，通过环二磷酸鸟苷酸（cGMP）途径调节VEGF表达［7］。在脑梗死早期，缺血区半暗带内氧含量不足，低氧作为刺激信号通过HIF-1使缺血区半暗带VEGF及其受体表达增强，诱导血管内皮细胞增生，形成大量新血管，建立侧枝循环，改善缺血区供氧状况，促进该区神经和细胞功能的恢复，减轻缺血引起的脑损伤。

在不同的脑缺血状态下，VEGF mRNA、VEGF蛋白和VEGF受体的表达在时间和分布上存在一定的差异性。Lennmyr F等［8］研究发现，在大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）2 h 再灌注早期，VEGF mRNA表达并未增加，并且随存活时间的延长呈现下降趋势。

1.3 VEGF在血管新生中的主要作用

VEGF在血管新生中的主要作用包括促血管内皮细胞增殖、迁移；诱导内皮细胞上相应配体和受体表达；增加细胞间黏附分子和血管细胞黏附分子的水平；上调内皮细胞表面整合素受体的表达，诱使骨桥黏合蛋白与之结合；上调丝氨酸蛋白酶活性，从而降解稠密的细胞外基质，促进血管形成。

Chen H H等［9］在大脑中动脉缺血再灌注（MCAO）动物模型中发现，血管新生在缺血1 w～2 w明显可见，在缺血半暗带区最为明显，此区血流量减少，但并非完全阻断，此处血流量的细微差异就足以决定细胞是否存活。Marti H J等［10］的研究表明，MCAO后24 h血管内皮细胞开始增生，血管样结构从软脑膜和脑实质的血管向缺血区发展。永久性局灶性脑缺血半暗带区的VEGF表达于缺血后2 d～14 d内持续增高，新血管的形成始于缺血后6 h～24 h，并一直延续 28 d［11］。 Sun Y 等［12］对 MCAO 大鼠脑内注射外源性VEGF，通过第Ⅷ因子（vWF）免疫组化观察发现，VEGF注射组新生血管比正常组高2倍，比缺血对照组高4倍。

2 Notch/Delta信号通路的结构及生物活性

2.1 Notch/Delta信号通路的结构

Notch/Delta通路是广泛存在于脊椎和非脊椎动物的重要信号传导通路，与其他多个高度保守的细胞传导通路一起构筑起生物发展的信号骨架，决定细胞的命运，影响器官形成［13］。有研究报道Notch/Delta信号通路对血管的发生发展，包括细胞增殖、迁移、平滑肌分化、血管生成、动静脉分化等多个方面有重要的调控功能［14］。Notch受体是由Notch基因编码的一组高度保守的跨膜蛋白，在邻近细胞产生的配体的活化作用下，通过一系列分子间的相互作用，精确地调控各谱系细胞的增殖分化［15］。在脊椎动物中，Notch受体有4种同源体，即Notch1～Notch 4。整个分子跨越细胞膜，其表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）重复序列能与配体结合并激活Notch信号。Notch具有多种配体，称为Delta配体家族。目前发现哺乳动物中有 Delta1、Delta-like3（Dll3）、Delta-like4（Dll4）、Jagged1、Jagged2。Notch 基因编码的蛋白合成后先在胞内糖基化递呈到细胞膜上，再与邻近细胞膜上的配体连接；然后，在胞外区S2位点由金属蛋白酶介导裂解，随后由早老素依赖的γ-分泌酶（γ-secrease）介导的胞内区S3位点发生裂解，释放的NICD进入细胞核内，与胞核上的靶基因结合形成多蛋白-DNA复合体转录因子CSL，激活相关基因Hes1/5等并进行转录，生成Hes1/5等编码的核bHLH蛋白家族成员；继而激活、调节其下游的靶基因，最终影响细胞的分化、增殖和凋亡。

2.2 Notch/Delta信号通路与血管新生

Notch受体介导的信号转导途径参与了新生血管的形成［16］，而Gridley T最新的一系列实验表明Notch受体与邻近细胞的Delta样配体4（delta-like ligand 4，Dll-4）共同调节了该过程［17］。

Notch4是特异性分布在血管内皮并且是分布在毛细血管内皮上的唯一的Notch受体，在Notch信号调控血管内皮发生发育过程中发挥着重要的作用［18］。Krebs L T等［16］实验结果表明Notch4调控血管发生发育、血管网形成，抑制后期血管分支发育，其表达较正常增多或减少都会使血管发育受损。作为Notch配体之一，Dll4是一种重要的血管生长发育调节因子，主要存在于胚胎和成年组织的血管内皮细胞［19］。 Hofmann J J 等［20］研究发现，Dll4 主要在新生血管末端顶细胞中表达，Dll4的组织定位暗示它与新生血管的生长和发育有着密切联系。

Gridley T［17］发现当缺血缺氧时，内皮细胞 Dll4表达上调，激活邻近细胞Notch4受体，进而启动细胞内信号传导，诱导Notch/Delta信号通路的靶基因Hes3、Shh表达而促使血管发生和形成。Androutsellis-Theotokis A 等［21］进一步实验表明，用分泌酶抑制剂抑制Dll4的表达，则内皮细胞增殖、迁移和血管网形成均受到抑制，血管形成减少。这一过程中，细胞间质信号 （包括丝氨酸/苏氨酸激酶Akt和转录因子STAT3）也被快速激活。Dll4-Notch信号的正常传递有利于新生血管中特定类型细胞的密度、位置和行为方式的确立，最终保证正常血管的形成。

3 VEGF与Notch/Delta信号通路共同调节血管新生

有研究报道，VEGF可以诱导动脉内皮细胞中Dll4和其受体Notchl表达，但内皮细胞中Dll4的过表达可以减弱VEGF诱导的细胞增殖和迁移。这个事实说明，VEGF是Dll4的正向调节因素，而Dll4是 VEGF 信号的负调节因素［22］。 Suchting S 等［23］通过实验证明，当VEGF信号途径被阻断后，小鼠血管内皮顶端细胞中Dll4的表达减少，从而使血管分支发育过程受阻。Leslie J D等［24］研究发现Dll4-Notch信号缺陷时正常情况下停止生长的内皮细胞持续增殖和迁移，若VEGF和Dll4-Notch信号转导通路被同时阻断，则内皮细胞保持静止状态不再增殖。结合这一系列的实验可以得出，作为血管形成正向调节因子的VEGF，通过诱导Dll4的表达而启动Dll4-Notch信号，作为负的反馈调节因素而有效预防过量的血管形成，从而促进一个分化良好的血管网根据环境的需要而及时形成。

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