蛋白质组学技术及其在消化系统肿瘤中的应用*

张 亚 王学春

(泰山医学院，山东 泰安 271016)

蛋白质组学是研究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的科学[1],近年来它被广泛应用于生命科学的各个领域。蛋白质组的研究不仅有助于揭示生命活动规律，还能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论依据和解决途径。通过对正常个体及病理个体间的蛋白质组比较分析，可以找到某些“疾病特异性的蛋白质分子”[2]，它们可能为疾病的早期诊断提供一些新的分子标志。消化道肿瘤是我国死亡率最高的疾病之一。在过去30年中, 针对肿瘤的研究, 尤其是在致癌机制方面, 取得了显著的进展。然而, 临床检测及治疗上的进展却相对缓慢。蛋白质组学的引入, 通过提供大规模高通量的蛋白质分析的技术手段, 为肿瘤蛋白质标志物的检测提供了新方法, 为肿瘤的诊断及治疗提供了新途径。本文重点综述了蛋白质组学技术在消化系统肿瘤中的应用。

1 蛋白质组学概述及其相关技术

1994年，澳大利亚科学家Wilkins和Williams首次提出了蛋白质组学(proteomics)概念，蛋白质组学主要是系统性研究一种基因组、一种生物，或者一种细胞(组织)所表达的全套蛋白质[1]。其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态、了解蛋白质之间的相互作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。由于蛋白质是组织、细胞功能的主要执行者，是基因通往细胞功能的桥梁，因此蛋白质组学能更真实、更直接地体现生命现象的本质，能更深入地揭示各种复杂生命活动的机制。蛋白质组学的核心技术包括样品制备、分离、鉴定和生物信息分析等。

1.1 样品制备

样品制备是蛋白质组分析成功与否的关键,应具有良好重复性,并与后续分离和鉴定方法相匹配。与核酸不同，目前没有一种通用的方法适用于所有的蛋白质，不同来源的样本需要不同的提取和裂解技术。近几年发展起来的激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection，LCM)是一项可以直接从组织样品中获取特异细胞群的技术，该技术对双向电泳的标本制备具有重要作用，可以精确地从组织切片中取出研究者感兴趣的细胞类型，从而获得纯净的蛋白质样品，是目前解决组织异质性操作中较理想的方法[3]。

1.2 蛋白质分离技术

目前，由O’Farrell PH等人[4]发明的双向电泳技术( Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis, 2D-PAGE) 仍是获得蛋白质图谱的主要手段，其原理是根据蛋白质等电点和分子量的不同将蛋白分离。2-DE的缺点是重复性差, 对膜蛋白兼容性差, 缺乏小分子量和大分子量的信息, 对于极端pH的蛋白也无法分辨检测。针对重复性差的问题,产生了荧光标记的2-DE, 也就是 DIGE(diferential in gel electrophoresis)技术[5]。该技术运用不同的荧光染料分别标记不同的蛋白质样品,然后将它们等量混合起来,在单一的双向胶上进行分离和检测,按照它们所发出荧光的不同,来比较在不同细胞状态下蛋白质量的变化。DIGE可对图谱上蛋白质点之间的差异表达进行研究,进一步提高2-DE的重复性及蛋白质的真实改变程度,其不足主要在于样本数量的局限性。

近年来新的分离蛋白质的非凝胶技术得到发展，并在蛋白质组学研究中广泛应用，这些非凝胶技术的应用简化了蛋白质组研究步骤，又可与质谱联用实现自动化，是2-DE技术的有效补充。液相色谱法/高效液相色谱(high performance liquid chromatography， HPLC)是近年来发展迅速的非凝胶的新方法，具有高分辨率，可直接用于高复杂性蛋白质混合物的分析，对低丰度蛋白的检测能力超过2D-PAGE[6]。毛细管电泳是目前对生物大分子分辨率很高的分离分析技术。即在高电场强度作用下,对毛细管(内径5～10 μm) 中的待测样品按分子质量、电荷、电泳迁移率等差异进行有效分离。具有进样量小,可操作性强,分离高效、快速的特点,并且易于同其他监测方法连用,是微分离分析中最有效的方法之一。该技术弥补了双向凝胶电泳无法实现自动化分析的不足,并可用于分子量范围不适用于双向电泳样品的检测,对单一样品尤为适用,但对复杂样品的分离尚不完全[7]。

1.3 蛋白质鉴定技术

蛋白质鉴定主要依靠质谱技术(MS)分析。电喷雾质谱(ESI - MS)和基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF -MS)技术的发明及在蛋白质分析中的成功应用,使具有极高灵敏度的质谱技术成为蛋白质组研究的核心工具,其基本原理是通过电离源先将样品分子离子化,再根据各离子间荷质比(m/z)的差异分离蛋白质,并确定其分子量和PI等属性参数[8]。表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(SELDI - TOF - MS) 技术是近年出现的,是目前蛋白质组学最常应用的技术,该技术是利用经过特殊处理的固相支持物或芯片的基质表面,制成蛋白质芯片,根据蛋白质生化特性不同,选择性地从待测生物样品中捕获配体,将其结合在芯片的固相基质表面上,利用激光脉冲辐射使芯片表面的待分析物解析成带电离子,质荷比不同的离子在电场中飞行时间不同,据此绘制出质谱图。检测结果经过软件处理后可直接显示样品中各种蛋白质的分子量、含量等信息[9]。 SELDI - TOF - MS 技术不需要双向电泳预先分离蛋白质,可直接从各种体液和组织中找出疾病相关蛋白质,获得样品中目标蛋白质的分子量。此检测技术灵敏度高,具有高通量、快速、操作简便、样品用量少和对多种样品平行分析检测等特点,具有很好的临床应用前景[10]。

1.4 生物信息分析

2-DE所得到的图像可利用图像分析软件进行分析, 通过数据库查询质谱结果, 还可对感兴趣的未知蛋白质进行结构和功能方面的分析。

2 蛋白质组学在消化系统肿瘤中的应用

2.1 肝癌

近年来肝癌发病率在我国有上升趋势，其死亡率占恶性肿瘤死亡率的前列。肝癌的预后极差，五年生存率低于5%[11]。Sun S等[12]应用2-DE技术寻找肝细胞性肝癌中潜在的参数标志物，他们对224例肝组织标本(105例癌组织，103例癌旁组织和16例正常组织)进行双向电泳分析，发现β-actin(ACTB)、heat shock protein 60(HSP60)和protein disulphide isomerase(PDI)三种蛋白标志物在不同组织中的变化比较稳定。同时应用Western blot、免疫组化、实时定量PCR进行验证，证实ACTB和HSP60变化情况与2-DE结果基本一致。他们认为ACTB和HSP60有望成为肝癌早期诊断的可靠蛋白参数标志物。Codarin E等[13]应用2-DE和MALDI-TOF-MS分析技术对20名肝癌患者的癌组织及配对癌旁组织进行研究，得到包括200个普通蛋白点在内的蛋白质图谱，其中证实含有52个差异基因相对应的蛋白表达产物。通过蛋白差异分析发现16个明显变化的蛋白点，这些蛋白与组成细胞骨架，应激反应和发挥代谢功能相关。本项研究可能为肝癌诊断提供新的蛋白标记物并且为肝癌病理变化和转移机制提供新的思路。Li N等[14]联合应用2-DE和MALDI-TOF质谱技术比较分析了18例肝癌组织及癌旁组织(包括12例LC源性和6例慢性乙型肝炎源性肝细胞肝癌)之间蛋白质表达谱的差异，鉴定了17 个具有显著性表达差异的蛋白质，其中十个蛋白点在癌组织中上调，其余7个蛋白点下调。而c-Jun N-terminal kinase 2 和 ADP/ATP carrier protein 仅在慢性乙型肝炎源性肝癌(CHB)组织中上调，nsulin-like growth factor binding protein 2和Rho-GTPase-activating protein 4分别只在LC源性和CHB源性肝癌组织中下调。另外该实验还发现在HBV源性肝癌组织中有6个新的差异表达蛋白。

2.2 胃癌

胃癌仍是全世界最常见的恶性肿瘤之一，也是恶性肿瘤患者最常见的死亡原因之一。胃癌目前在世界范围内癌症相关死亡中列第二位，在我国居于首位。仅2002年全球范围内就有新增患者约90万例，死亡人数超过70万例。胃部肿瘤很少在临床前期被发现或确诊，从而导致预后普遍较差[15]。 2003年，Ryu JW等[16]比较胃癌与正常胃黏膜组织的蛋白组差异，得到1500个蛋白点，对140个蛋白点进行鉴定，发现在胃癌组织中有7 个上调蛋白质：NSP3、 Prohibitin 、Transgelin、热休克蛋白27及其变异体、二硫化物异构酶A3蛋白、葡萄糖相关蛋白等；7 个下调蛋白点：载脂蛋白A-1、P20、二磷酸核苷异构酶A、α1-抗胰蛋白酶、支架蛋白、血浆白蛋白和血清转铁蛋白。2009年Mohri Y等[17]运用SELDI技术检测胃癌组织和血清：组织分析发现115个差异位点，其中包括HNPs1-3在内的上调蛋白位点65个，下调蛋白位点50个；血清中发现MIF蛋白位点上调。2007年中科院张军等[18]应用2-DE和MALDI-TOF/TOF MS技术发现胃癌组织中12个上调和13个下调蛋白点；他们认为MAWBP可能成为胃癌新的蛋白标志物之一。2008年第二军医大学吴成等[19]应用2-DE和MALDI-TOF MS方法研究胃癌标志物，发现9个上调点：HSP60、肌间线蛋白、 效应细胞蛋白酶受体1、 MnSOD 、plice form 1b、 hypothetical protein、 unnamed protein product；20个下调点：硒结合蛋白1、纤维蛋白原、HSP27、微管蛋白α6、锌指蛋白160、前列腺合酶F、真核翻译延伸因子-α1。他们认为MnSOD有可能成为胃癌新的蛋白标志物。

2.3 食管癌

食管癌在我国的发病率和死亡率均居于恶性肿瘤的前列，但病因学与发病机制至今不甚明了。食管癌的发生演进是一个多层次、多因素导致的复杂过程，其产生发展涉及多种基因与蛋白的协同作用。近年来有关食管癌的研究主要集中在癌基因/抑癌基因的改变与食管癌的相互关系，如myc、ras、EGFR、Cyclin D1、p53、Rb等。蛋白质组学技术已越来越广泛的应用于致癌机制的研究以及肿瘤相关蛋白的鉴定。Xu SY等[20]采用SELDI-TOF-MS和CM10蛋白质芯片技术分析了139例食管鳞状细胞癌(ESCC)病人和49例正常对照者血清样本,发现了283个血清蛋白峰(0～20kDa),其中140个蛋白峰在食管癌病人和正常对照者血清中出现显著差异。该实验建立了一个由六个蛋白峰(m/z 5667, 5709, 5876, 5979, 6043，6102)组成的诊断模型，利用统计学分析软件,诊断的敏感性达到97.12%,特异性达到83.87%,研究表明这是一项有前途的早期诊断ESCC准确率高且无创的方法。Uemura N等[21]为寻找食管癌的预后标记物，采用荧光差异显示凝胶电泳(2D-DIGE)技术分离并筛选不同荧光素标记的预后好(9例生存率超过5年且无复发迹象的患者)和预后差(24例术后2年死亡的患者)的食管癌组织的差异表达蛋白质，用质谱(MS)技术进行鉴定并分析。结果共筛选出22个具有统计学意义的差异表达蛋白质点。其中发现Transglutaminase 3(TGM3)与食管癌患者预后程度呈负相关。另外又对76名不同预后程度ESCC患者的TGM3水平进一步进行免疫组化检测：TGM3阳性患者5年生存率为64.5%，TGM3阴性患者5年生存率为32.1%。这项研究首次表明TGM3可作为食管癌新的预后标记物，TGM3表达水平的监测有望为预防ESCC复发提供一种新的治疗策略。Fu等[22]对分化程度不同的食管鳞状上皮细胞癌所表达的蛋白质组进行研究。与正常食管组织相比,在食管鳞状上皮细胞癌中有18个蛋白位点表达出现差异,其中alpha-actinin 4 (ACTN4) 和67 kD laminin receptor ( 67LR)的表达水平从肿瘤I期到III期渐升。用组织微阵列技术( tissue microarrays, TMA)研究其与临床病理学的联系,揭示了ACTN4过表达与肿瘤的侵袭、转移潜能有关,但67LR的过表达则只与肿瘤的恶性程度有关。他们认为该两种蛋白可以成为食管鳞状上皮细胞癌诊断和治疗的靶点。

2.4 结直肠癌

结直肠癌是临床常见的消化道肿瘤之一，在各种恶性肿瘤中居第3位,在癌症导致死亡的病因中占第四位，其发病率呈逐年上升趋势，且整体治疗水平不尽人意。临床上30 %～40 %的患者在就诊时已属中晚期,实施根治性切除术后肿瘤的复发转移率仍高达40 %～70 %[23]。Kim等[24]运用功能蛋白质组学方法对结直肠癌转移和侵袭潜能进行研究，发现N-乙酰葡糖胺基转移酶v(GnT-V)能使金属蛋白酶-1抑制因子(TMP-1)的糖基化过程发生异常改变，这种异常糖基化使TMP-1对基质金属酶-2，9的抑制作用减弱，从而间接地增强结直肠癌转移和侵袭的潜能。盛新华等[25]收集结直肠癌(68例)、其他恶性肿瘤(乳腺癌、胃癌、食管癌、肝癌、肺癌及肾癌各25例)血清标本共218份，应用表面增强激光解吸/电离-飞行时间-质谱检测其蛋白质指纹谱。用Biomarker Wizard软件分析结直肠癌与其他恶性肿瘤患者血清中的低分子差异蛋白后，分别作出受试者工作特征(ROC)诊断曲线。再选取ROC曲线下面积(AUC)>0.8的蛋白，建立Fisher判别模型。结果显示结直肠癌与其他恶性肿瘤相比，血清中有12种蛋白相对高表达，102种蛋白相对低表达。ROC曲线显示，有75种蛋白AUC>0.5，其中8911、8919、8964、11726、14049、14139 M/Z的蛋白AUC>0.8。 用这6种蛋白建立的Fisher判别模型， 鉴别结直肠癌的敏感性88.2%，特异性93.3%，准确率91.7%。他们认为结直肠癌与其他恶性肿瘤相比，血清中存在明显差异表达的低分子蛋白，对结直肠癌具有诊断特异性， 值得进一步研究。

2.5 胰腺癌

胰腺癌是外科治疗效果最差的肿瘤之一，其5年生存率不足3%[26]。Kakisak 等[27]研究了异常表达的胰腺癌患者的血浆蛋白质。分别取胰腺癌病人与健康对照组的血浆，在去除高峰度蛋白后进行荧光双向差异凝胶电泳(2D-DIGE)。2D-DIGE 构建的胰腺癌病人和健康对照组的血浆蛋白差异表达图谱显示：胰腺癌病人血浆33个差异表达的蛋白点，其中27个上调、6 个下调。经质谱鉴定和生物学分析，上调的亮氨酸富集α-2-糖蛋白(LRG)以前从未在胰腺癌蛋白质研究文献中涉及，而且通过了免疫组化验证，提示该检测可作为胰腺癌诊断、鉴别诊断的重要指标，此研究推进了临床LRG 血浆水平的测量。金红等[28]采用双向凝胶电泳和生物质谱技术，对12对胰腺癌组织和癌旁组织样品、3个胰腺良性疾病样品、3个正常胰腺组织样品的蛋白质进行了分离和鉴定, 获得了重复性较好的双向凝胶电泳图谱；鉴定了胰腺癌和癌旁组织的差异表达蛋白质, 发现了30个差异表达蛋白质；应用MALD I-TOF-MS/MS技术对差异表达蛋白质进行鉴定, 共有24个蛋白质得到鉴定, 其中15个蛋白质在胰腺癌组织中表达上调， 9个蛋白质表达下调。这些蛋白质与胰腺癌的发生相关，可能成为胰腺癌的分子标志物和药物治疗的靶蛋白。

3 不足和展望

由于蛋白质组是一个动态、变化的整体，生物体内的蛋白质不能像核酸一样通过PCR扩增来增加样品量，因此其复杂性远远大于基因组。而蛋白质组学可以从整体、动态、网络水平上研究蛋白质,为诠释复杂生命活动提供新视角,有助于深入了解疾病过程中潜在的分子机制。目前，运用蛋白质组技术分离和鉴定肿瘤标志物的研究还处在初级阶段，那些被发现的新的肿瘤相关的蛋白标志物还需进一步扩大样本量，通过严格的对照来评价其特异性。由于肿瘤的发生和发展是多步骤和多基因参与的十分复杂的过程，结合基因组所提供的大量信息，相信使用蛋自质组技术将会大大加快对肿瘤标志物的研究进程。

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