间充质干细胞修复心肌的旁分泌效应机制

张润峰, 高连如 (中国人民解放军海军总医院心脏中心, 北京 100048； 通讯作者,E-mail:lianru@yahoo.com.cn)

1976年 Friedenstein等报道了骨髓中存在克隆性生长的基质细胞,1991年 Cap lan等正式将这类细胞命名为骨髓间充质干细胞(BMSCs)。BMSCs是具有自我更新、分化增殖和多向分化潜能的干细胞。许多研究显示,骨髓以外的其他器官中也广泛存在着结缔组织干细胞,体内所有这类干细胞统称为间充质干细胞(MSCs)。因取材方便,自身移植无免疫排斥反应,MSCs被广泛应用在组织工程、细胞移植、基因治疗等临床方面。目前 MSCs已成为一种理想的治疗心肌损伤的移植细胞[1]。

越来越多的研究发现,MSCs具有旁分泌功能[2],其治疗缺血性心脏病有赖于其旁分泌作用机制[3]。MSCs的旁分泌机制主要表现为促进新生血管生成、抗心肌细胞凋亡、趋化其他细胞参与心肌修复等 3个方面。本文就 MSCs修复心肌的旁分泌作用机制进行综述。

1 MSCs分泌多种生物活性因子

最近研究显示,MSCs至少分泌 34种蛋白质[4]；其中分泌 10种不同的生长因子,10种不同的细胞因子、化学趋化因子及其他的蛋白质。MSCs所分泌的这些蛋白质类物质对组织的修复具有不可估量的作用[5]。

1.1 分泌生长因子及其受体 Kinnaird等研究证实[6],MSCs可表达促血管生成素 1/2(Ang 1/2)、血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(PGF)、成纤维细胞生长因子(FGFs)、血小板源生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子 -β(TGF-β)、胰岛素样生长因子 (IGF-1)、生长激素(GH)和肝细胞生长因子(HGF)等多种生长因子。这些生长因子参与调节细胞凋亡、增殖、营养、支持、存活、迁移、归巢、分化和表型等多种细胞反应。

MSCs同时还可表达多种生长因子受体,如MSCs表达 VEGF受体 -1(VEGFR-1)；人 MSCs表达的 VEGFR-1介导了该细胞对血管内皮生长因子A(VEGF-A)的反应[2]。

1.2 分泌多种细胞因子和化学趋化因子 人类ESCs可分泌多种细胞因子,如趋化因子(CXCL6)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、化学增活素(GRO-a)、NCC4、胰岛素样生长因子结合蛋白(IFGBP)、IL-1β、白细胞抑制因子、单核细胞化学趋化蛋白 -1(MCP1)、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)等,其调节功能涉及代谢、防御反应和组织分化[7]。移植大鼠骨髓 MSCs诱导缺血肾脏 IL-1β、TNF-α等促炎细胞因子下调,而 IL-10、TGF-α明显上调,从而减轻肾脏损伤[8]。

BMSCs主要高度表达与成骨细胞黏附和血管生成及重塑有关的因子,包括Ⅰ型胶元、纤维粘连蛋白(fibronectin)、层粘蛋白(laminin)和玻连蛋白(vitr onectin)[2]。人类 MSCs表达整合素 α2、α4、α5和 β1等,介导干细胞黏附到内皮细胞,参与细胞保护[9]。

1.3 分泌调节肽 未分化的 MSCs表达肾上腺髓质素(ADM)、降钙素、降钙素基因相关肽(CGRP)等的 mRNA；IL-1β和多糖均能诱导脂肪源 MSCs表达降钙素、CGRP和 ADM[2]。脂肪 MSCs还表达局部肾素 -血管紧张素系统中的肾素、血管紧张素受体、血管紧张素和血管紧张素转换酶[10]。BMSCs可分泌心钠素、脑钠素等细胞活性物质[11]。

1.4 分泌干细胞特异性活性因子 干细胞还产生一些特异性活性因子,不仅调节干细胞自身的存活、迁移、归巢和增殖等过程,还调节靶组织的功能与修复。这些因子包括干细胞因子(SCF)、干细胞衍生因子(SDF-1)等[2]。

SDF-1是 G蛋白偶联受体 CXCR4的配体,干细胞不仅分泌SDF-1,还表达CXCR4,SDF-1及其受体 CXCR4通过 SDF/CXCR4信号途径抑制 MSCs凋亡,并在干细胞动员和归巢中具有重要作用。大鼠急性心肌梗死后尾静脉注射过表达 SDF-1的 MSCs后心功能改善的程度明显高于 MSCs注射组,并增加梗死区心肌细胞存活率和血管密度[12]。徐亚丽等的研究证实,MSCs通过旁分泌机制在心肌缺血区产生丰富的 SDF-1,并借助其强大的动员、趋化、迁移功能,促进 MSCs黏附、归巢缺血心肌,并在局部促进血管新生,参与受损心肌的修复[13]。

2 M SCs修复心肌的旁分泌作用机制

有研究者将过表达 Akt的 MSCs移植入心肌损伤的大鼠心脏内,结果显示 MSCs-Akt对受损心肌具有较强的修复作用,且只有少量的 MSCs分化为心肌细胞。由于 Akt可调节多种细胞因子及其分泌,因此他们提出移植入心脏部位的 MSCs的旁分泌作用有可能是 MSCs修复受损心肌的机制[14]。

Gnecchi等[15]的研究发现,Akt-MSCs移植后 72 h内即可观察到心功能的改善,提示此显著效果不可能来自于移植细胞的心肌再生作用,而只可能是移植细胞的旁分泌作用。

Dai等[16]报道,MSCs移植入心梗大鼠梗死区后3个月才能检测到部分肌细胞血管内皮细胞表型,而全部表型的出现则需 6个月时间；但在移植后 4周即可检测到心功能增强。由此推测,移植的 MSCs通过旁分泌途径参与了早期心功能的改善。Tang等[17]将 MSCs注射到心梗大鼠的梗死边缘区,2周后 bFGF、VEGF和 SDF-1表达升高,Bax表达下降,左室收缩性明显提高,提示 MSCs通过旁分泌作用促进了血管再生并抑制心肌细胞凋亡,从而改善了心功能。

干细胞心脏移植的有益作用是由于旁分泌机制,还是由于其增殖分化产生新的心肌样细胞所致,一直是干细胞研究争论的热点问题。上述研究结果有力地证明了 MSCs旁分泌作用的存在；随着干细胞旁分泌效应机制的深入研究,人们开始倾向于从干细胞旁分泌作用上解释其移植效应。MSCs修复心肌的旁分泌效应机制研究进展如下。

2.1 提高梗死心肌 MSCs移植存活率 MSCs是用于治疗心肌梗死的供体细胞,但低存活率和移植后低成功生长率始终限制其应用。美国加州大学Pons等[18]研究发现,VEGF可减轻 MSCs应激,增加促 MSCs存活因子以及磷酸化 Akt和 Bcl-xL蛋白表达,促进 MSCs增殖。MSCs与 VEGF一起作用于梗死心脏,可明显增加 MSCs的移植成功生长率,进而改善心功能。因此,通过促进 MSCs旁分泌 VEGF,即可解决 MSCs移植后低存活率问题。已有学者利用超声联合微泡引起的机械效应和空化效应刺激局部内源性 VEGF的分泌；他们采用诊断超声联合微泡介导下经静脉移植 MSCs,通过 Western blot检测VEGF蛋白定量,证实超声 +微泡 +MSCs组的VEGF蛋白表达最高,且显著高于经静脉移植 MSCs组及对照组,差异有统计学意义[13]。

2.2 激活心肌源干细胞 越来越多证据表明,心肌并非终末化组织,存在心肌源干细胞,可向心肌细胞分化；MSCs等外源性干细胞发挥心肌修复作用有限,最终需依靠心肌源干细胞激活、分化并迁移到心肌梗死区域重建心肌[19]。曹青等研究证实,MSCs旁分泌作用能够促进心肌源干细胞内心肌钙蛋白T、缝隙连接蛋白 -43和转化生长因子 βⅢ型受体的表达,并提高 smad2蛋白磷酸化程度,激活心肌源干细胞向心肌细胞分化[20]。

以往的研究认为,移植的干细胞虽可在梗死心肌存活,但数量少；虽可表达心肌细胞表型标记,但未能证明移植的干细胞可分化为成熟、有完全功能、与本身心肌相连、真正再生的心肌细胞。因此,MSCs通过旁分泌作用激活心肌源干细胞,使之分化为成熟的心肌细胞这一发现,为干细胞研究提供了新的方向,也将为干细胞研究做出重大而实质性的贡献。

2.3 促进血管新生 移植细胞能分泌促血管生长的细胞因子如 VEGF和 bFGF,促进侧支循环建立；刺激宿主心肌组织分泌 VEGF,促进原血管系统再生成。

Fuchs等[21]实验证实,MSCs在体内外均可增加局部血管内皮生长因子的水平,从而促进局部血管的新生。Tang等[17]将体外培养的 MSCs移植到 SD大鼠冠脉结扎区域内,8周后取材行免疫组化染色计算血管密度,结果显示 MSCs移植组大鼠急性心肌梗死区的血管密度明显高于对照组,血管内皮生长因子在移植组的表达显著高于对照组。

Kennard等[22]利用大鼠的后肢制作缺血模型,然后将自体的 MSCs注射入其缺血部位。发现移植的干细胞分泌的血管生成因子,促进大鼠后肢血管的再生并且改善了血供。

2.4 抗细胞凋亡 Xu等[23]证实,富含 VEGF、bFGF、SDF-1、IGF-1的 BMSCs与心肌细胞共培养减轻缺氧诱导的心肌细胞凋亡。Akt基因修饰的 MSCs可以通过旁分泌的抗凋亡作用保护缺血心肌[15]。Akt-MSCs培养基明显抑制缺氧诱导的细胞凋亡并触发体外成年心肌细胞强烈的自主收缩,向缺血心肌注射该培养基后明显限制心肌梗死范围、改善心功能,表明 Akt-MSCs介导的心脏保护机制涉及MSCs的抗凋亡机制[24]。

2.5 抑制免疫炎症反应 MSCs具有独特的免疫抑制特性,可以抑制淋巴细胞增殖、抗原呈递细胞的活化与成熟,移植到受体后具有一定程度的免疫抑制和炎症调节作用。

TGF-β1是已知的具有免疫调节作用的因子。张伟等[25]研究发现,MSCs分泌较高水平的 TGF-β1,抑制 T细胞的活化与扩增,参与多种生物过程,包括维持免疫稳态和诱导自身耐受。

移植 MSCs可下调大鼠梗死心肌促炎细胞因子肿瘤坏死因子 -α和白细胞介素 -6的表达,上调抗炎细胞因子白细胞介素 -10的表达,提示 MSCs可调节心肌梗死后所伴随的免疫炎症反应,通过调节心肌梗死后的促炎/抗炎因素的平衡来保护心肌细胞,抑制心室重构[26]。

2.6 保护和恢复细胞外基质的完整性 Sam等[27]证实,MSCs能分泌一些基质成分修复受损伤的宿主细胞外基质,从而恢复宿主心肌细胞的结构性支撑,限制梗死区域的扩大和改善梗死局部的收缩功能。韩瑜等[28]的研究表明,大鼠 BMSCs的缺氧和无血清条件培养液能够通过旁分泌刺激心脏成纤维细胞自身合成胶原能力的增强,提示移植到缺血心肌缺血区的 BMSCs可能通过旁分泌作用影响心脏成纤维细胞的胶原合成,从而参与心肌的修复。

3 影响 MSCs旁分泌效应的因素

3.1 缺氧 缺氧是诱导干细胞分泌功能的重要刺激因素。人类 MSCs在单纯缺氧条件下可分泌多种细胞因子,如 FGF-2、FGF-7、IL-1、IL-6、TGF-b、TNF-α、VEGF等。缺氧激活 MSCs释放 VEGF是通过STAT3和 p38MAPK途径介导,STAT3基因敲除小鼠缺氧诱导的 MSCs分泌功能下降[2]。

与常氧相比,缺氧可显著促进 Akt蛋白表达,提示缺氧虽可致细胞凋亡、增殖滞缓,但仍可促进 Akt较强表达,提示 MSCs在缺氧环境下,可能通过提高Akt的“保护性”机制而参与细胞增殖、减轻细胞凋亡等[29]。

MSCs对单纯缺氧损害较耐受,缺氧后促红细胞生成素信号通路的主要成分均显著上调,提示促红细胞生成素信号通路在 MSCs耐缺氧和旁分泌保护能力中起着重要作用[30]。

3.2 机械力的牵拉 机械力的牵拉会引起心肌细胞基因表达,蛋白合成增加,改变心肌细胞内信号转导；因此,机械牵拉也会在某种程度上对具有成肌分化潜能的 MSCs的基因表达与蛋白合成产生一定影响。

3.3 生长因子和细胞因子 MSCs的分泌功能受生长因子和细胞因子调节。TGF-β下调 MSCs中MCP-5表达,该作用在小鼠股动脉结扎致后肢缺血模型上得到证实。TNF-α刺激小鼠骨髓 MSCs分泌VEGF,并活化 p38-MAPK和 STAT3途径；p38-MAPK抑制剂明显抑制野生型小鼠 TNF-α诱导的 VEGF分泌[2]。

4 总结与展望

迄今为止,细胞移植产生临床效果的机制仍不十分清楚。旁分泌作用在 MSCs移植过程中起着非常重要的作用。MSCs在局部缺氧、缺血微环境中,可能分泌多种生物活性因子,各种因子能够作用于邻近的心肌细胞和成纤维细胞,通过复杂的旁分泌途径调节某些基因的表达,并促进血管再生及侧支循环形成,抑制细胞凋亡,对降低了的脏器功能产生一定的代偿作用。

MSCs旁分泌功能的揭示,对于人类疾病的治疗具有重大而深远的意义。相信随着 MSCs的旁分泌功能的深入研究,人类可积极有效地调动干细胞旁分泌这种机体内源性的调节和保护机制,有望实现对 MSCs存活、增殖、分化等的全方位调控；或直接应用干细胞分泌的活性因子替代细胞,治疗心肌梗死,从而解决目前干细胞研究中存在的一系列问题:如心脏剧烈的炎症反应导致干细胞无法存活,移植的干细胞的数量与活性不足,自体细胞来源受限,潜在的不安全性。

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