SRAP与TRAP分子标记及其在植物研究中的应用

冯尚国,赵红燕,胡 旭,施农农,应奇才,王慧中

(杭州师范大学生物化学与分子生物学杭州市重点实验室,浙江杭州310036)

SRAP与TRAP分子标记及其在植物研究中的应用

冯尚国,赵红燕,胡 旭,施农农,应奇才,王慧中＊

(杭州师范大学生物化学与分子生物学杭州市重点实验室,浙江杭州310036)

文章详细阐述了SRAP和TRAP标记的原理、引物设计、扩增检测条件及特点,综述了两种标记近年来在植物遗传多样性、遗传图谱构建及重要性状基因标记研究等方面的最新应用,并对其应用前景进行了展望.

SRAP;TRAP;分子标记;植物;应用

分子标记(Molecularmaker)与形态标记(Morphologicalmaker)、细胞标记(Cytologicalmaker)、生化标记(Biochemicalmaker)共同组成遗传标记的四大标记.后3种标记是基因表达的结果,是对基因的间接反映,标记数目有限,多态性较差,易受环境条件的影响;而分子标记是直接在DNA分子上检测生物间的差异,是在DNA水平上遗传变异的直接反映,能对不同发育时期的个体、任何组织器官甚至细胞进行检测,数量多,遍及整个基因组,多态性高,遗传稳定,不受环境及基因是否表达的限制.在近30年里,分子标记技术得到了快速发展,目前DNA分子标记已达几十种,在植物遗传多样性分析及鉴别、基因作图、基因定位、遗传育种及基因克隆等方面已经得到了广泛的应用.

从核心技术角度来讲,DNA分子标记可以分为四类.第一类:基于分子杂交技术的标记,如RFLP、VNRT等;第二类:基于PCR扩增的标记,如RAPD、SSR、ISSR、AFLP等;第三类:基于DNA序列分析的标记,如nrDNA的内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)和cpDNA编码基因(matK、rbcL等)及trnL-F非编码区等;第四类:基于DNA芯片技术的标记,如单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)等.

在此介绍近年来发展起来的两种新的基于PCR扩增的分子标记——序列相关扩增多态性(SRAP)和目标区域扩增多态性(TRAP),对两种标记的原理、引物设计、扩增检测条件、特点及最新应用做详细综述.

1 SRAP与TRAP的原理、引物选择、扩增及特征

1.1 SRAP分子标记

相关序列扩增多态性(Sequence-Related Amp lified Polymo rphism,SRAP),由美国加州大学蔬菜作物系Li与Quiros于2001年在芸薹属植物中开发出来[1],是一种基于PCR的新型分子标记技术,又名为基于序列扩增多态性(Sequence-based Amp lified Polymorphism,SBAP)[2].

1.1.1 SRAP分子标记的原理

SRAP通过设计一对特异的引物对开放阅读框(ORFs)进行扩增[1],SRAP上下游引物在组成上很相似,都是由核心序列和3个选择性碱基组成.上游引物长17 bp,其中5’端的前10 bp是一段没有任何特异性的填充序列,和紧接着它的CCGG序列共同组成核心序列,在3’端有3个选择碱基.下游引物长18 bp,其中核心序列包括11个碱基的填充序列和AA TT特异性序列,在3’端同样有3个选择碱基.上游引物中的CCGG序列可与开放阅读框(ORFs)区域中的外显子特异性结合,下游引物中的AA TT序列特异结合于富含A T区的内含子和启动子.这样上下游引物结合可以同时对外显子、内含子和启动子区域进行特异性扩增,并且因为个体不同及物种的内含子、启动子和间隔序列不同而产生多态性.

1.1.2 SRAP引物选择

引物设计对于SRAP分析十分重要.前后引物3’端的随机引物可以自行变化,但是正反向引物组合不应形成发夹结构或者二聚体,并且CG含量为40%～50%,同时两者填充序列组成必须不同,长度分别为10 bp和11 bp.另外,引物片段大小决定SRAP成功与否.Li等[1]通过实验发现,用单引物扩增仅能得到几条长度约为500～1 000 bp的片段;用类似RAPD引物或仅含SRAP引物核心序列长度为10～15 bp的较短引物,能得到多种扩增片段,但是不稳定,重复性差.Li等[1]同时发现,20～22 bp的引物扩增出的结果背景太深,SRAP引物最合适的片段长度为17～18 bp.

1.1.3 SRAP-PCR程序、电泳检测及片段测序

SRAP反应模板可以使用基因组DNA,也可以使用cDNA.SRAP-PCR反应程序采用特殊的复性变温法[1],在起初的5个循环中,退火温度使用35℃,目的是保证引物与相应DNA序列充分配对;在随后35个循环中退火温度设为50℃,目的是保证前5个循环的扩增产物可在余下循环中进行指数式扩增.扩增产物可以在变性聚丙烯酰胺凝胶上分离[3-4],也可以在琼脂糖凝胶上分析[5-6],同时用非变性聚丙烯酰胺凝胶分离也有文献报道[7].SRAP引物较长,而且扩增条带非常清晰,几乎没有重叠现象,所以相对于A FLP更易测序.SRAP标记差异片段可直接测序,也可以采取克隆测序.

1.1.4 SRAP标记的特点

SRAP作为一种新型的分子标记,与其他分子标记技术相比,有自己的优点:1)多态性高,上下游引物结合同时对外显子、内含子和启动子区域进行扩增,因个体不同及物种的内含子、启动子和间隔序列不同而产生多态性.2)共显性标记,SRAP具有高频率的共显性,相对于类似RAPD、ISSR的显性标记,SRAP能提供更多的遗传信息.3)DNA需要量少,仅需20～30 ng,并且对DNA纯度要求低.4)简单,检测多样化,与AFLP相比,不用酶切、连接、预扩等步骤;同时SRAP扩增产物检测可以用变性聚丙烯酰胺凝胶,也可以用非变性聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶.5)花费少,改变SRAP引物3’端3个选择性碱基可设计大量的引物序列,同时上游引物与下游引物可以自由组合,因此,大大减少了合成引物的费用,同时也提高了引物的使用率.

1.2 TRAP分子标记

目标区域扩增多态性(target region amp lified polymo rphism,TRAP)是从SRA P标记技术改进过来的,由美国农业部北方作物科学实验室Hu和Vick在2003年[8]提出,同样是一种基于PCR技术的标记. TRAP标记利用已知的cDNA或EST序列信息来设计引物,对目标候选基因区域进行扩增产生多态性,这一点与RAPD、ISSR、AFLP和SRAP等标记无须任何序列信息即可直接扩增有所不同.

1.2.1 TRAP分子标记的原理

TRAP标记技术的原理是运用生物信息学工具和EST序列信息,产生目标候选基因区域多态性标记.该标记利用两个长度为16～20 bp的固定引物和一个随机引物进行组合,通过对目标区域进行扩增,产生围绕目标候选基因序列的TRAP多态性标记[8].

1.2.2 TRAP标记的引物设计

TRAP与RAPD、ISSR、AFLP及SRAP等标记的不同主要在于TRAP的固定引物设计时需要知道所研究植物的EST序列信息.固定引物设计程序主要是:首先从EST数据库中选择所需序列,再用引物设计软件(如Primer 3或Primer 5等)设计引物序列的合理长度(18 bp)以及最适、最大和最小Tm值(53℃、55℃、50℃),然后从软件生成的引物中,选择一个最为合适的作为固定引物.

TRAP的随机引物可与内含子或外显子进行配对,其设计与SRAP引物设计模式相似[8]:在引物的5’端设计有一段填充序列;紧接着构建一个含4～6个富含A T或GC核苷酸的核心区;在引物的3’端连接3～4个随机碱基.同时TRAP随机引物设计遵循一般引物设计原则:引物不能发生自连,GC含量控制在40%～60%.

1.2.3 TRAP-PCR程序、电泳检测

TRAP-PCR反应程序与SRAP的相似,也是采用复性变温法[8]:首先94℃预变性2 min;然后5个循环(94℃变性45 s,35℃复性45 s,72℃延伸1 min);接下来再进行35个循环(94℃变性45 s,50℃复性45 s,72℃延伸1 min);最后72℃延伸7 min.使用复性变温法的目的和SRAP的一样.TRAP-PCR的扩增产物,通常在6.5%的聚丙烯酰胺凝胶上分离,通过放射自显影或银染技术检测.每个扩增产物通过6.5%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离可产生50～900 bp的片段30～50个.与RAPD、A FLP等标记相比, TRAP标记具有操作简单、重复性好、多态性高、效率高等优点.

2 SRAP与TRAP标记在植物研究中的应用

SRAP标记和TRAP标记最先分别是从芸薹属植物和向日葵(Helianthus annuus L.)中开发出来的,近年来,两者以各自独特的优点广泛应用于植物研究中的多个领域,主要被应用于遗传多样性分析、图谱构建、重要性状基因标记和比较基因组学等研究.

2.1 遗传多样性分析

利用分子标记技术研究植物的遗传多样性,可以快速分析植物之间的亲缘关系、种类鉴定、物种起源等,给有利种质资源的保护和合理利用提供更为可靠的依据.SRAP和TRAP标记有多态性好、稳定、操作简单等优点,在植物遗传多态性研究中有广泛的应用.

Ferriol等[9]利用SRAP和AFLP对西葫芦(Cucurbita pepo)的69份有代表性的样品进行遗传多态性分析,发现与A FLP相比,SRAP分析得到的结果与形态变异和形态类型的进化史更为一致.Budak等[7]利用34对SRAP引物组合分析野牛草种质资源的遗传多样性与表型之间的关系,结果根据相似度把53个样品材料分为8个组,基因型之间的遗传距离系数介于0.33和0.99之间.Sun等[5]首次利用SRAP对采自不同国家和地区的31种灵芝菌株(Ganoderm a population)进行遗传多样性分析,6对SRAP引物组合共获得85个多态性条带,并将31个菌株聚为5类,结果显示了这些灵芝菌株的遗传多样性及其与地理环境的关系;同时证明了SRAP可以在真菌系统分类分析中应用.Vandemark等[10]用SRAP标记对15个紫花苜蓿种群(其中包括6个公众品种和9个历史上公认的苜蓿种质起源的种群)进行遗传多态性分析,得到的结果和以秋眠为依据所分析得到的预期结果基本一致.Ortega等[3]利用SRAP对采自秘鲁库斯科地区6个不同地区的块茎旱莲花的栽培种和非栽培种进行遗传多样性分析,发现块状旱莲花是一种基因易变的作物,相似系数分布于65%～99%之间,其中最为孤立的区域——Sayllafaya的块状旱莲花遗传变异性最大.同时一个重要的发现是大部分非栽培品种是由栽培品系逃逸出去的,而非天然的野生种. Yu等[11]利用ISSR和SRAP对毛木耳(Auricularia polytricha)的19个菌株进行遗传多态性分析,13个ISSR引物和14个SRAP引物组合分别扩增得到202和459条多态性条带,多态性比分别为99.0%和95.9%.两个标记得到的系统发生树把19个菌株分别聚类为5组和4组,结果表明了毛木耳之间存在着高水平的遗传多样性及它们之间的亲缘关系,同时证明,两种标记都适合于毛木耳菌株鉴别,其中SRAP标记更合适,效率更高.Han等[6]利用23对SRAP引物组合对牡丹的3个野生种和63个栽培种进行遗传多样性分析,在扩增出的296个扩增位点中,有262个是多态性的.在聚类图中,野生种Paeonia lud low ii和P.delavayi聚成不同的两类,并且有着很强的自引支持度,野生种P.ostii则和所有的栽培种关系比较近.栽培种根据各种相应的引导指标被分成不同的组.Ding等[12]利用SRAP标记对铁皮石斛进行研究,用TFPGA软件得聚类图把9种铁皮石斛84个植株聚为两类,和N TSYS分析结果一致.王长林等[13]利用SRAP分子标记分析明党参的遗传多样性,结果将10个不同居群的明党参分为两大类,证明了明党参不同居群间具有高度的遗传多样性;不同居群的亲缘关系与其地理分布有一定的相关性.张安世等[14]运用SRAP分子标记对18个北方粳稻品种进行了分类和亲缘关系研究,发现北方粳稻品种的SRAP分析结果与系谱法基本吻合.孙建等[15]利用SRAP分子标记对江淮主产区8个芝麻品种进行指纹图谱分析,结果用1对引物Em07/M e09便可将8份芝麻品种区分开来.李莉等[16]利用19对SRAP引物组合对原产中国的枣属全部14个种、11个枣品种和1个外类群的基因组DNA进行分析,UPGM A聚类表明,26份材料在相似系数0.38处被划分为6个类群.陈大霞等[17]对18个不同来源地的川党参种质进行SRAP和ISSR分析,29条SRAP引物组合共得到329条扩增条带,其中有266条呈现多态性,占80.85%,平均遗传相似系数为0.712 1;21条ISSR引物共得到223条扩增条带,其中有166条呈现多态性,占74.44%,平均遗传相似系数为0.778 1.2种标记均表明川党参具有较高的遗传多样性.笔者利用SRAP分子标记技术对31个石斛物种进行了遗传多样性研究,结果显示SRAP分子标记在石斛中具有很高的多态性,可以用于石斛遗传多样性的研究,相关研究成果将随后报道.

Hu等[18]用TRA P标记构建了生菜的53个栽培品种和6个野生品种的指纹图谱,用10条固定引物和4条带有荧光标记的随机引物进行组合,在10个PCR反应中共扩增出769条多态性片段.这些标记不仅可以区分所有栽培品种,而且可以显示出3个物种之间的进化关系:与L.saligna相比,栽培品种L. sativa与L.serriola亲缘关系更近,这与先前利用RFLP、AFLP和SAM PL标记所得的结果一致.Hu等[19]利用TRAP标记对48个采自不同地区的菠菜样品(38个菠菜种质品种和10个商业杂交种)进行遗传多态性分析,12对引物组合扩增出492条片段,其中96条是多态性片段,多态性比为19.5%,能把48个品种完全区分开,并且发现品种间的遗传关系和地域分布联系不大.

2.2 遗传图谱构建

Li等[1]首先把SRAP技术用于86个羽衣甘蓝×花椰菜的RI系作图,获得由130个SRAP标记和120个AFLP标记构成的遗传图谱.Lin等[20]首次运用SRAP构建了棉花的遗传图谱.Wang等[21-22]把SRAP标记用于黄瓜的图谱构建中.Yu等[23]利用SSR、TRAP、SRAP和AFLP构建四倍体棉花高密度连锁图谱,共产生1 252个多态性位点,连锁图谱包括1 097个标记(包括697个SSRs,171个TRAPs,129个SRAPs,8个AFLPs和2个形态学标记).图谱长度为4 536.7 cm,平均遗传距离为每个标记4.1 cm. Sun等[24]利用SRA P标记技术对甘蓝型油菜构建超高密度遗传图谱,1 634个引物组合产生13 551个SRAP图谱标记,构建成19个连锁群.图谱长度是1 604.8 cm,标记密度是8.45 SRAPs/cm,大约100 kb长度含有1个以上标记.Gao等[25]利用SRAP和SSR构建了甘蓝的高密度遗传图谱,图谱包括1 257个标记,大小为703 cm,包括9个连锁群.A lwala等[26]利用AFLP、SRAP和TRAP标记技术对甘蔗(Saccharum interspecific cross)构建图谱,两个亲本分别为Saccharum of ficinarum‘La Striped’(2n=80) and S.spontaneum‘SES 147B’(2n=64),另外,取100个F1代植株.共产生344个多态性位点,其中247 (72%)个位点符合1∶1分离,33(9%)个分离比为3.3∶1,近似于3∶1,64(19%)个多态性位点属于偏分离位点.Lin等[27]利用SRAP结合SSRs、RAPDs和RGAPs标记技术对陆地棉(Gossypium H irsutum) DH962(G.hirsutum accession)×Jimian5(G.hirsutum cultivar)杂交得到的F2代构建高密度的遗传连锁图谱,471个多态性位点(包括309个SRA Ps,144个SSRs,16个RAPDs和2个RGAPS)共构建51个连锁群,并指出大部分SRAPs引物组合在图谱构建中都是很有效的.郭印山等[28]运用SRAP、RAPD、ISSR和AFLP分子标记首次构建了龙眼的高密度分子遗传图谱,为后续的基因定位及辅助选择奠定了良好的基础.高丽霞等[29]采用拟测交作图策略,利用白姜花×圆瓣姜花的F1群体87个单株,分别构建了父母本的基于SRAP标记的连锁图谱.笔者利用SRAP结合RAPD分子标记首次构建了石斛的遗传连锁图谱,为以后定位石斛中重要性状基因以及辅助育种奠定了重要基础,相关研究成果另文报道.

Liu等[30]利用TRAP结合SSR分子标记,构建硬红春小麦种内重组杂交群体的遗传图谱,共产生700多个标记,其中,图谱由352个标记组成,总长度为3 045 cm,平均密度为每个标记8.7 cm,1个SSR反应平均可检测到1.9个多态性位点,而TRAP反应1次可检测到24个多态性位点.结果显示TRAP分子标记在小麦遗传图谱绘制中是非常有效的.Hu[31]以RHA 280×RHA 801杂交产生的92个F7重组近亲繁殖系(RIL)为材料,利用TRAP标记来界定向日葵连锁图谱末端,结果显示这些与端粒相关的标记给连锁图谱的完整性提供了精确的评价,同时对实际遗传长度进行了较好的估计.Chu等[32]用TRAP和SSR标记构建小麦双单倍体品种的全基因组遗传图谱,整个图谱由632个标记构成,其中包括SSR标记410个,TRAP标记218个,另外还有1个RFLP标记和3个形态学标记.图谱大小为3 811.5 cm,标记之间平均遗传距离为6.03 cm,根据TRAP标记可以确定7个连锁图谱的端点.

2.3 重要性状基因标记

2003年,Li在大白菜中发现了1个与雄性不育基因相关的SRAP标记,在油菜中获得1个与Rf连锁的SRAP标记,在芹菜中筛选出1个与病毒抗性基因连锁的SRAP标记.Rahman等[33]在芜菁中开发出1个与控制种皮颜色的主效基因(B r1/br1)连锁的SRAP标记.Rahman等[34]在甘蓝型油菜中开发了与控制芥酸含量基因连锁的SRAP、SNP和SCAR标记,并将这3种标记成功应用于油菜育种工作中.M utlu等[35]在茄子中获得了与枯萎病抗性基因连锁的SRAP、SRAP-RGA、RAPD和SCAR标记.刘艳等[36]采用分离群体分组分析(Bulked Segregate Analysis,BSA)法,对棉花抗病基因进行SRAP分析.结果在88对SRAP引物中筛选出3对引物(S6-6、S6-10、S8-8)在两亲本及抗、感基因池中均能扩增出稳定的差异条带.通过F2代个体验证,抗病个体均能扩增出此差异条带,而感病个体中不能扩增出此差异条带,证明这3对引物是与棉花抗病基因紧密连锁的SRAP分子标记.郁有健等[37]以紫色大白菜BC1回交群体的120个单株为材料,采用混合集群分析法构建大白菜的紫色与非紫色池,应用SRAP分子标记技术筛选两池间的多态性,并对与紫色性状相关的Q TL和对应的连锁关系进行了初步分析.应用获得的8对引物组合对120个单株的DNA进行SRAP分析,初步获得3个与紫色性状相关的QTL:qp-c1-1、qp-c1-2和qp-c1-3,同时获得6个与这3个Q TL连锁的标记,其中m7e11-490、m6e8-210、m7e11-900n和m6e8-100n4个标记与其最近QTL位点的连锁距离分别为0.1,0.1,0.2,2.2 cm.这为紫色白菜的分子辅助育种提供了科学依据.

Hu等[8]利用TRAP标记研究向日葵,获得了一个与葵盘腐烂病(Sclerotinia head ro t)感病基因相关的分子标记.Wang等[38]在小麦中利用TRAP和SSR标记分析了两个抗麦秆瘿蚊基因H26和H13的遗传特征,并且对两者进行了分子标记定位.Chen等[39]通过人工诱导得到不育系HA 89,然后获得雄性不育突变体NM S 360,利用TRAP和SSR研究NM S 360×RHA 271杂交得到F2群体,6个TRAP引物组合检测出与ms9基因(具控制雄性不育的功能)连锁的分子标记,其中,Ts4p03-202和Tt3p09-529与ms9基因完全连锁,其他4个标记To3d14-310,Tt3p17-390,Ts4p23-300和Tt3p09-531与ms9基因不完全连锁,其遗传距离分别为1.2,3.7,10.3及22.3 cm.这些标记通过与ms9基因紧密连锁,有利于从隔离种群中把雄性不育植株分离出来.Rojas-Barros等[40]在对向日葵栽培品种控制顶端分枝基因定位研究中发现15个与b1基因座相连的TRAP标记.A lwala等[41]用AFLP、SRAP和TRAP分子标记绘制了甘蔗2个亲本S.oycinarum和S.spontaneum的遗传连锁图,报道了与产糖性状相关的标记基因.

另外,SRAP和TRAP在植物比较基因组学[42]和辅助育种[43]等方面也有所应用.

3 SRAP和TRAP的应用前景

SRAP和TRAP分子标记技术有操作简单、多态性高、重复性好、共显性高、费用低等优点,是比较理想的分子标记技术,在植物遗传多样性、图谱构建及重要性状基因标记研究等方面具有重要的应用价值.目前,两种标记技术在植物多个研究领域中得到了快速发展.随着分子标记技术的不断发展和基因库EST序列的不断丰富,相信SRAP和TRAP分子标记技术在植物研究中将会发挥更加重要的作用.

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SRAP and TRAPM olecular Markersand Their Application in Plan ts Research

FENG Shang-guo,ZHAO Hong-yan,HU Xu,SH INong-nong,YING Qi-cai,WANG Hui-zhong
(Key Labo ratory of Hangzhou City fo r Biochemistry and Molecular Biology,Hangzhou No rmal University,Hangzhou 310036,China)

The article expatiates the p rincip les,p rimers design,amp lification conditions and characteristicsof SRAP and TRAPmarkers,overview s the app lications of the two markers in genetic polymo rphism analysis,genetic linkage map constructions and important genetic marker traitsof p lants,and view s the p rospect of their application.

SRAP;TRAP;molecular marker;plant;app lication

Q37

A

1674-232X(2010)03-0178-07

DO I:10.3969/j.issn.1674-232X.2010.03.004

2009-12-21

国家自然科学基金(30670199,30770185,30870180);浙江省科技计划项目(2008C12081,2006C32016);杭州市重点实验室项目(20080432T06);钱江人才计划资助项目.

冯尚国(1980—),男,山东菏泽人,遗传学专业硕士研究生,主要从事植物分子遗传学研究.

＊通讯作者:王慧中(1962—),男,浙江义乌人,教授,主要从事植物分子生物学研究.E-mail:w hz62@163.com