亚甲蓝光化学法血浆病毒灭活对凝血因子Ⅷ的影响

房景霞 刘鑫 孙绍秋 李玉梅 房辉

输注病毒灭活血浆成为目前国内外预防输注血浆制品传播传染病的有效措施。亚甲蓝光化学法灭活病毒是最近几年才发展起来的新技术，该法灭活血浆中病毒的效果已被证实，我国部分地区血站已广泛推广应用。亚甲蓝是一种染料，属于吩噻嗪类药物，是临床上常用的解毒剂，主要用于治疗亚硝酸盐和氰化物中毒。它能与病原微生物核酸和蛋白质结合，在适当波长的荧光照射下，发生一系列光化学或光生物效应导致病原体失活。灭活病毒的效果与亚甲蓝浓度，光照温度、时间、强度，血袋容量等因素有关。本血站自2009年6月末起，采用该法对血浆进行病毒灭活，为了解病毒灭活后血浆中凝血因子Ⅷ的变化，以及该法影响凝血因子Ⅷ含量改变的因素，对病毒灭活前后的凝血因子Ⅷ的含量进行检测。

1 材料与方法

1.1 研究对象 随机抽取唐山市中心血站2009年10至11月无偿献血全血标本60份(400ml/份)，均于采血后6 h内滤除白细胞，离心，制备成新鲜液体血浆(200ml/份)。将血浆无菌留样2ml(Ⅰ组)，检测其中的Ⅷ因子含量。另外无菌留取2ml血浆(Ⅱ组)不加亚甲蓝，剩余的血浆加入亚甲蓝，将它们均放入病毒灭活箱中灭活。

1.2 试剂与仪器 一次性使用去白细胞塑料血袋(山东威高集团医用高分子制品股份有限公司，批号:0908153，有效期:2011.07);一次性使用病毒灭活装置配套用输血过滤器(淄博中保康医疗器具有限公司，批号:20090626，有效期:2011.05);J6-MZ大容量低温离心机(美国Beckman公司);HDME-1A型医用病毒灭活箱(上海输血技术有限公司);低温血液滤器工作柜(天津市正源制冷设备有限公司LBC2-22);SE250型高频热合机(深圳达科为医疗器械有限公司);CompoDock型无菌导管连接器(德国);STatr4半自动血凝仪(法国Stago公司);乏Ⅷ因子血浆(批号:S302002，有效期:2012.02)、APTT试剂(批号:TE090722，有效期:2012.12)、CaCl2 试剂(批号:00806031，有效期:2012.12)、IBS 稀释液(批号:S0903005，有效期:2012.12)均由德国Marbury公司生产。

1.3 新鲜血浆的病毒灭活处理 将血浆通过无菌导管连接器与一次性使用病毒灭活装置配套用输血过滤器连接，向血浆中加入亚甲蓝，混匀后使其终浓度为1 μmol/L左右，将加入亚甲蓝的血浆平放入病毒灭活箱中的搁架上进行照射，搁架的摆动频率为60次/min，光照强度为30000～38000 lux，温度为2～8℃，照射时间为35min。在低温血液滤器工作柜内，温度为2～8℃，将光照后的血浆通过病毒灭活过滤器滤除亚甲蓝，混匀后无菌留样2ml(Ⅲ组)。检测Ⅱ、Ⅲ组血浆中的Ⅷ因子含量。

1.4 检测方法 Ⅷ因子含量的检测采用STatr4半自动血凝仪，严格按照凝血因子Ⅷ检测试剂的说明书方法操作。

2 结果

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组血浆Ⅷ因子水平分别为(0.86 ±0.02)、(0.81±0.02)、(0.78 ±0.02)U/ml，3 组血浆Ⅷ因子水平间差异无统计学意义(P ＜0.05)。

3 讨论

临床上不安全的输血除了免疫的因素之外，主要是来源于病原微生物以及其代谢产物的污染，特别是病毒的传播已经对输血的安全性构成了肯定并且后果严重的威胁。国内外的研究报道均证实大多数的输血后病毒感染是由“窗口期”问题引起的。在美国90%以上的输血传播人类免疫缺陷病毒(HIV)和乙型肝炎病毒(HBV)以及75%以上的输血传播丙型肝炎病毒(HCV)的危险均是来自“窗口期”感染的献血。目前国内各采供血机构按照卫生部的要求只进行乙肝表现抗原(HBsAg)、抗HCV、抗HIV，梅毒抗体等的检测，并没有要求对其他如人类嗜T细胞病毒(HTLV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)等病毒进行检测。此外，可能通过输血传播疾病的新病毒也在不断的被发现，这些造成了不能完全的剔除血液中的病毒。因此，要从根本上控制和杜绝输血传播的病毒性疾病，除了要加强献血者的筛查之外，还必须要对血液进行病毒灭活处理，这样才有可能达到输血安全的目的。血液中的病毒灭活的方法有很多，亚甲蓝光化学法灭活血浆病毒是近几年发展起来的新技术，可以使大多数的脂质包膜病毒和部分的非脂质包膜病毒灭活，特别是对HCV、HBV、HIV等病毒的灭活效果更是理想，是目前惟一获准用于临床的光化学血浆病毒灭活的技术［1］。国内的部分地区血站已经广泛推广应用。亚甲蓝本身是治疗氰化物、亚硝酸盐、醌类、苯胺及硝基苯等所引起的高铁血红蛋白血症的药物，与临床上亚甲蓝的使用剂量相比，用于血浆病毒灭活的亚甲蓝使用剂量(1 μmol/L即300μg/L)是极其微量的，只相当于高铁血红蛋白血症治疗剂量的几百分之一。因此，在毒理学上是安全的。光化学法灭活病毒的机理主要是依靠光敏剂在光照度条件下，产生自由基(一类机制)或者单线态氧(二类机制)氧化损伤病毒的分子结构，从而达到杀灭病毒的效果，与此同时，也造成了血浆中活性成分的损伤。

在本实验中通过对随机抽样的30份亚甲蓝光化学法灭活血浆病毒的凝血因子Ⅷ的含量进行了检测，与未经灭活处理的同份血浆(Ⅰ组)相比，灭活后的凝血因子Ⅷ的含量(Ⅲ组)有所下降，再次证明了亚甲蓝光化学法灭活血浆病毒在杀灭病毒的同时，会对血浆中的有效成分造成影响，但差异无统计学意义(P＞0.05)，Ⅷ因子的含量仍然符合国家的标准，与国内外其他的实验所得的结果相似，说明光照灭活过程中的热变性效应是造成凝血因子Ⅷ含量变化的重要因素［2］。除了热效应和光化学反应是凝血因子Ⅷ含量变化的重要影响因素之外，还与时间、温度、耗材和测量的方法等诸多因素有关。目前对单一人份的血浆病毒灭活国内外大多采用亚甲蓝光化学法，其使病毒滴度减少的程度与所用的光照强度和亚甲蓝浓度直接相关［3］。亚甲蓝光化学法进行血浆病毒灭活，对血浆中凝血因子Ⅷ含量无显著影响，灭活过程中的热效应和光化学反应是凝血因子Ⅷ含量改变的重要因素。

1 钱开诚.血液成分病毒灭活研究的进展.中国输血杂志，2004，17(增刊):36-38.

2 程玉根，柏则蓉，贾红志.亚甲蓝光化学法灭活血浆病毒对血浆成分的影响.临床血液学杂志(输血与检验版)，2007，4:169-170.

3 黄文杰，范恩勇，孙海英，等.亚甲蓝光化学法病毒灭活血浆对凝血因子的影响.实用医学杂志，2006，22:2193.