儿茶素抗氧化微量法探讨

肖 娴,康文艺

(1.河南大学淮河医院外科,河南 开封 475001;2.河南大学药学院,河南 开封 475004)

儿茶素抗氧化微量法探讨

肖 娴1,康文艺2＊

(1.河南大学淮河医院外科,河南 开封 475001;2.河南大学药学院,河南 开封 475004)

目的:利用具有清除DPPH自由基活性的化合物儿茶素建立一种体外微孔板抗氧化模型。方法:通过单因素考察,建立L9(34)正交试验,对结果进行直观分析和方差分析,确定最适实验条件。验证实验证明该方法的稳定性;标准品对照实验,表明该模型的准确性。结果:最适实验条件是A3B1D2,即DPPH的最佳浓度为250μmol/L,加入量为125μL,反应20min;验证实验 RSD为1.06%。结论:DPPH抗氧化微量筛选模型快速,准确,用样量小,且稳定可靠,适合天然产物抗氧化活性筛选使用。

儿茶素;微孔板;DPPH;抗氧化模型

儿茶素(Catechin)是绿茶多酚的主要有效成分,存在于茶树(Camel Iiasinenis o.Ktze.)等多种天然药用植物中[1],其药理作用广泛,有人总结为“三抗”、“三降”和“三消”[2]。因其电子传递机理[3]而具有很强的抗氧化活性[4]。我们以儿茶素为研究对象,通过微孔板法试验,建立一种微量法筛选模型,可用于天然产物的批量快速筛选。

1 实验材料

1.1 试剂

DPPH(日本东京化成工业株式会社)、PG(pro pyl gallate,没食子酸丙酯,Sigma批号:A019043001)、BHA(Butylated hydroxyanisole,丁基羟基茴香醚,Sigma 批号:A019438801)、BHT(Butylated hydroxy toluene,二丁基羟基甲苯,Sigma批号:A020158601)、Trolox(Aldrich)、儿茶素(本研究所提供,纯度98%)。

1.2 仪器

Multiskan M K3酶标仪(美国 thermo Electron公司);UV-2000型紫外-可见分光光度计(尤尼可上海仪器有限公司);电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);CS-H1型混合器(北京博励阳科技公司);96微孔板;各种移液器及枪头等。

2 方法和结果

2.1 单因素考察

2.1.1 DPPH浓度的考察 选择DPPH(甲醇溶液)浓度为 300、250、200、150、100 和 50μmol/L。0.5mg/mL的儿茶素(甲醇溶液),对半稀释6个浓度。分别把不同浓度的儿茶素溶液10μl加入到96微孔板中,加入150μL DPPH溶液,反应20min后,在492nm处测定OD值(n=6);用SPSS13.0软件处理实验数据,得到儿茶素清除DPPH自由基的半数抑制浓度即 IC50值,并进行单因素方差分析(表1和图1)。

表1 DPPH浓度的影响(,n=6)

表1 DPPH浓度的影响(,n=6)

图1 DPPH浓度的影响

由图1可知,IC50随着DPPH浓度增加,呈现一定线性的增加,且在200μmol/L时增加最慢,查阅相关中外文献发现,在DPPH微量法的不同筛选体系中,DPPH浓度范围在50～300μmol/L[5-10],故选取200μmol/L。

2.1.2 DPPH加入量的考察 选择DPPH(甲醇溶液)加入量为 250、225、200、175、150、125 和 100μL,DPPH浓度取200μmol/L,其他操作同2.1.1(n=6);(图2)。

图2 DPPH加入量的影响

由图2可以看出,随DPPH加入量的增加,儿茶素由过量至完全与DPPH自由基作用,然后达到DPPH过量,而导致在100～250μL之间时,IC50呈波状上升趋势,在DPPH加入量为150μL时,儿茶素与DPPH作用最充分。

2.1.3 反应时间的考察 根据查阅DPPH微量法的相关文献,选择反应的时间为 60、50、40、30、20、10、0min,DPPH加入量为 150μL,其他操作同2.1.2(n=6);(见图 3)。

图3 反应时间的影响

随时间儿茶素与DPPH的作用充分,IC50值也相应的不断减小,前10min减小最快,10～20min次之,之后几乎没变化,20min时反应已基本充分。

2.2 正交实验

选择DPPH浓度、DPPH加入量和反应时间为主要因素,进行正交设计(表2),按L9(34)正交表试验(n=3),(表3和表4)。

表2 因素水平表

表3 正交试验设计及结果

由表3的 R值可知,各因素影响顺序是A>D>B。说明DPPH浓度是重要影响因素,反应时间和DPPH加入量次之。由表4可知,因素A有显著性影响,最佳水平为A3;因素B没有显著性影响,为了节省样品,取B1;因素D也没有显著性影响,结合实验操作所需的时间,取单因素考察的最佳水平D2。故最佳实验条件为:A3B1D2,即DPPH的浓度为250 μmol/L,加入量为 125μL,反应 20min。

表4 方差分析表

2.3 验证实验

按最佳实验条件进行验证试验(n=3),RSD为1.06%,结果稳定可靠。

2.4 标准品对照比较

采用Trolox作参比,PG,BHA和BHT作阳性对照。分别用微量法和分光光度法[11]对 Trolox,PG,BHA,BHT和儿茶素进行抗氧化活性测定,结果微量法得到的 IC50值约是分光光度法的3倍,但用 Trolox当量(单位是μmol/g,表示每摩尔样品清除DPPH自由基的能力相当于参比物 Trolox的微摩尔数)表示,因体系引起的差异;且2种方法测得的活性顺序一致,即 PG>儿茶素>BHA>Trolox>BHT。证明微量法在评价待测物的抗氧化活性时,和分光光度法一样准确。

3 讨论

我们参阅国外有关文献,通过单因素试验,建立L9(34)正交试验,对结果进行直观分析和方差分析,确定适宜的条件为A3B1D2,即DPPH的浓度为250 μmol/L,加入量为125μL,反应 20min。验证实验RSD为1.06%,表明该模型稳定可靠,有良好的精密度和重现性。用 Trolox作参比,PG、BHA和BHT作阳性对照,与分光光度法相比较,2种方法所得Trolox当量高度相关(r=1),表明因体系引起的误差已经消除,微量法可以准确衡量样品清楚DPPH自由基的能力。另外,微量法可检测到浓度在1.1～38μg/mL之间的样品,灵敏度有所提高。

我们首次把正交试验引入到DPPH抗氧化模型的建立中,并且分别对DPPH微量法的稳定性、准确性和可行性进行了系统的考察和分析,为DPPH微量法的应用和发展提供了科学依据。

综上所述,用儿茶素所建立的抗氧化微量模型与分光光度法相比,快速、准确、用样量小,且稳定可靠,适合天然产物单体抗氧化活性的快速筛选。

[1]彭长连,陈少薇,林植芳,等.用清除有机自由基DPPH法评价植物抗氧化能力[J].生物化学与生物物理进展,2000,27(6):658-662.

[2]范娟,许士凯.茶多酚药理作用的研究进展[J].现代中西医结合杂志,2002,11(22):2301-2302.

[3]毛清黎,施兆鹏,李玲,等.茶叶儿茶素保健及药理功能研究进展[J].食品科学,2007,28(8):584-589.

[4]Wang L F,Zhang H Y.A theoretical study of the different radical-scavenging activities of catechin,quercetin,and rationally designed planar catechin[J].Bioorganic Chem,2005(33):108-115.

[5]Sang S M,Cheng X F,Stark R E,et al.Chemical studies on antioxidant mechanism of tea catechins:analysis of radical reaction products of catechin and epicatechin with 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl[J].Bioorganic &Med Chem,2002(10):2233-2237.

[6]Orhan I,Kartal M,Nac Q,et al.Antioxidant and anticholinesterase evaluation of selected Turkish Salvia species[J].Food Chemistry,2007(103):1247-1254.

[7]Wu T H,Yen F L,Lin L T,et al.Preparation,physicochemical characterization,and antioxidant effects of quercetin nanoparticles[J].International Journal of Pharmaceutics,2008,346(2):160-168.

[8]Hung T M,Na M,Thuong P T,et al.Antioxidant activity of caffeoyl quinic acid derivatives from the roots of Dipsacus asper Wall[J].J Ethnopharmaco,2006(108):188-192.

[9]Tseng S H,Chien T Y,Tzeng C F,et al.Prevention of hepatic oxidative injury by Xiao-Chen-Chi-Tang in mice[J].J Ethnopharmaco,2007(111):232-239.

[10]Chen F A,Wu A B,Shieh P,et al.Evaluation of the antioxidant activity of Ruellia tuberosa[J].Food Chem,2006(94):14-18.

[11]Badami S,Rai S R,Suresh B.Antioxidant activity of Aporosa lindleyana root[J].J Ethnopharmaco,2005(101):180-184.

[责任编辑 李武营]

Antioxidant assay for catechin with microplate based screening method

XIAO Xian,KANG Wen-yi(Huaihe Hospital of Henan University,Kaif eng,Henan475001,China;Pharmacelltical College of Henan University,Kaif eng,Henan475004,China)

Objective:To establish an antioxidant model of microplate assay in vitro by catechin which is a compound with the activities to eliminate DPPH free radical.Methods:L9(34)orthogonal experiment was established by the single factor exploration.The result was conducted the direct-viewing analysis and variance analysis to determine the optimum experiment conditions.The evaluation experiment showed that the method was stable and the control experiment of standard further certified the precision of the model.Results:The optimum condition was A3B1D2,that was,the concentration of DPPH was 250μmol·L-1,the addition volume of DPPH was 125μL and kept 20min at room temperature.RSD of the evaluation test was 1.06%.Conclusion:The microplate assay is rapid,accurate,stable and reliable for the screening antioxidant activity of traditional Chinese medicine with little sample,and it fits for the screening antioxidant activities of natural materials.

Catechin;Microplate;DPPH free radical;Antioxidant model

Q946.81

A

1672-7606(2010)04-0270-03

2010-10-08

肖娴(1980),女,河南 开封 人,护师,从事临床护理工作。

＊通讯作者:康文艺(1971-),男,黑龙江尚志市人,医学博士后,副教授,从事天然药物活性成分研究工作。