西甜瓜组织培养与遗传转化影响因子研究进展

孔维萍，程鸿，苏永全，刘东顺

（甘肃省农业科学院蔬菜研究所，甘肃兰州，730070）

建立高效的离体培养再生体系是植物遗传转化成功的基础。目前已能够通过器官发生途径获得西甜瓜再生植株，有的还建立了比较高频的再生体系[1～4]。西甜瓜生产中主要的问题是病虫害严重以及品质、产量不高等。目前利用遗传工程方法改良甜瓜种质的研究主要有转化病毒的外壳蛋白基因、耐盐基因和ACC氧化酶反义基因等，并获得了转基因植株[5～7]。本文对西甜瓜再生体系建立与农杆菌介导遗传转化的影响因素作了综述，为进一步开展转基因研究、创造新的种质资源，特别是抗性种质资源，提高育种水平奠定良好基础。

1 再生体系建立的影响因素

1.1 基因型

材料的基因型对愈伤组织的器官分化有决定性的影响。外植体的基因型是影响离体培养再生的内在因素。不同品种西甜瓜的组培情况差异极大，植株再生频率随基因型的不同而不同[8]，薄皮甜瓜的子叶组织培养再生能力比厚皮甜瓜容易得多。潘俊松等[9]对8个品种甜瓜子叶节离体培养的结果表明，基因型对子叶节丛生芽的诱导有较大影响，其中再生不定芽数最高的为12.5个，最低为7.2个。Galperin等[10]选用了30份材料研究，表明甜瓜器官的再生能力因基因型的不同而不同。孙治图等[11]以23种基因型材料的西瓜无菌苗子叶为试材，运用方差分析筛选高效基因型材料及芽诱导最适培养基。结果表明，基因型不同的材料诱导效果有明显差异，最高诱导率达到90.0%，筛选的芽诱导最适培养基为MS+6-BA 3.0 mg/L。

1.2 取材部位及时间

甜瓜组织培养研究中，目前大多数报道[12]指出不同基因型品种的幼嫩子叶都可得到较高频率的再生不定芽，而真叶、下胚轴、茎尖等部位再生频率很低。冯凤娟等[1]以新梢顶端展开的第2~3片叶在MS+6-BA 1.0 mg/L的诱导培养基上，外植体远轴面向下接触培养基，直接转入正常光周期下培养再生频率可达100%，平均每个外植体上可诱导出11株健壮植株。王果萍[13]以西瓜未成熟胚及子叶、幼苗茎尖、子叶及下胚轴切段进行离体再生培养结果表明，子叶诱导再生效果最佳。李娟等[14]以7种不同基因型西瓜为试材进行离体花药培养，对诱导愈伤组织的条件进行了研究，结果表明，西瓜离体花药诱导率达到了68.42%，为西甜瓜组织培养提供了新途径。

同一外植体不同部位不定芽诱导率与诱导方式有差异。马国斌等[15]的研究表明，西瓜和甜瓜组织培养中，子叶和真叶外植体切块形态学下端部位总是首先大量发生愈伤组织或分化出器官，而切块形态学上端则很少或几乎不发生愈伤组织或器官。王春霞等[16]对京欣1号西瓜子叶进行芽分化试验的结果表明，子叶的不同部位再分化能力并不相同。另外外植体切割以及培养方式对诱导出苗也有很大影响。潘俊松等[9]的研究表明，先切顶芽的后期成苗时出现畸形苗，切割1/3子叶的诱导率不如后切顶芽的，子叶老化快，产生黄化和萎缩等现象。孙天国的研究结果表明，横、纵切子叶外植体的愈伤组织生长速度、着生位置、芽原基的分布和生长速度均不同，出芽率差异也很大。认为纵切破坏了子叶表面最大的维管束，使植物体内内源激素的量减半，内外源激素的联合作用减弱，而使得诱导能力降低，抑制了芽的诱导与分化。培养方式也同样会影响甜瓜叶片的再生，冯凤娟等[1]的试验表明远轴面接触培养基是甜瓜叶片再生适宜的放置方式，分析其原因可能是因为叶背面气孔较多，角质层不发达，有利于营养的吸收。

1.3 培养基以及生长调节物质的种类和浓度

不同外植体选用相同的基本培养基，或同一外植体选用不同的基本培养基的不定芽诱导率均不同。于喜艳等[17]研究表明，改良的Miller培养基获得的不定芽诱导率较高。马国斌等[15]报道，改良的MS培养基也可得到较好的不定芽分化效果。邓向东等[18]的研究表明，LS培养基对哈密瓜的不定芽诱导效果较好，有提高不定芽生活力、增加不定芽数量的作用。这可能是由于甜瓜本身的内源生长素的含量比较高，而不需要人为添加，如果添加，就会引起愈伤组织的发生，不利于不定芽的诱导。可见，不同培养基均可诱导出不定芽，但不同品种甜瓜的适合培养基不同。

植物组织不同对植物激素的要求有很大变化，这取决于它本身的内生激素水平。冯凤娟等[1]的试验结果表明，甜瓜不定芽诱导中，生长素是非必要的，适宜甜瓜叶片诱导的培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L，不需要IAA。在甜瓜组织培养中，常用的细胞分裂素的类似物是6-BA和KT，生长素的类似物中常用的是IAA、NAA和IBA。添加不同的植物生长调节物质或组合的组培效应不相同。 邓向东等[18]在以 6-BA、ZT、KT、2iP和2，4-D诱导哈密瓜不定芽的试验中观察到，6-BA的诱导效果最好，其最适浓度为0.5 mg/L，而高浓度的ABA（2.0 mg/L）可以提高网纹哈密瓜的诱导率。此外，ABA对子叶诱导不定芽也有一定的作用。于喜艳等[17]用6-BA和IAA组合诱导的结果表明，低浓度的IAA（0.2 mg/L）有利于厚皮甜瓜子叶的分化，而对薄皮甜瓜几乎没有影响。李娟等[14]、曹华兴等[19]的研究结果也表明，培养基中激素的种类、用量和配比，对诱发小孢子启动、分裂、生长和分化起决定性作用。

此外如AgNO3、VC、脯氨酸、水解酪蛋白以及活性碳等添加物通过调节代谢过程对愈伤组织诱导及分化也有一定影响。

2 农杆菌介导遗传转化影响因素

遗传转化方法有农杆菌介导法、基因枪法、电击法、花粉管通道法等，目前西甜瓜遗传转化多采用农杆菌介导法。

2.1 菌株

目前，西甜瓜遗传转化中常用的菌株为章鱼碱型的LBA4404与农杆碱型的EHA105。Fang等[20]是最早报道用根癌农杆菌改良株系LBA4404，并成功地将NPTⅡ基因（抗卡那霉素基因）转入甜瓜品种。王慧中等[21]以含选择标记基因NPTⅡ和WMV-1CP（西瓜花叶病毒）基因双元载体pBEWMV的根癌农杆菌LBA4404感染甜瓜子叶外植体，获得可育的转基因甜瓜植株。颜雪等[7]也是采用农杆菌LBA4404对新疆感病甜瓜进行转化，获得抗枯萎病甜瓜新品种。张志忠等[22]分别用农杆菌菌株LBA4404、AGL-1和EHA105侵染同一西瓜品种，结果表明，EHA105的侵染能力明显优于LBA4404和AGL-1。李建勇等[23]用农杆菌LBA4404（含pCAMBIA1301重组质粒）转化浙密2号西瓜，经GUS检测获得抗性芽。

2.2 菌液浓度及侵染时间

农杆菌菌液浓度是影响转化效率的关键因素之一。浓度过低，农杆菌数目不足而影响侵染效率，浓度过高，农杆菌过度繁殖又会对外植体造成伤害，从而降低转化效率。另外适宜的侵染时间可以使较多的农杆菌附着于外植体伤口处；但时间过长，外植体在后期培养中易发生褐化死亡。李建勇等[23]将菌液浓度稀释到 OD600分别为 0，0.1，0.3，0.5，0.7， 侵染时间设为0，5，10，15 min，结果表明 OD 为 0.3，侵染时间 10 min效果最佳，侵染效率达67.7%。

2.3 预培养和共培养时间

预培养可以淘汰生命力弱的外植体，促使外植体尽早适应组织培养环境而进入萌动状态，在一定程度上提高转化率。但预培养时间过长则会使外植体切面表皮细胞形成潜伏芽，使转化率降低，假阳性率增高。共培养时间过短转化率极低，但共培养时间过长，农杆菌会过度繁殖，从而造成植物细胞因受到毒害而死亡，降低转化率。颜雪等[7]通过根癌农杆菌介导法将外源基因成功导入甜瓜中，采用的预培养和共培养时间均为3 d。李建勇等[23]的结论指出，预培养2 d，共培养时间为3 d时转化率最高，达到63.3%。

2.4 抗生素

在用根癌农杆菌转化植物细胞时，常用头孢霉素和羧苄青霉素控制根癌农杆菌的过量生长，而且两者除了抑制根癌农杆菌的生长外，还影响植物的生长发育。过量头孢霉素易引起伤口细胞褐化、死亡，抑制芽的分化；而羧苄青霉素则促进芽分化，抑制生根。李建勇等[23]指出，潮霉素对西瓜的分化有很强的抑制作用，随着潮霉素浓度的上升，外植体存活率显著下降，当潮霉素在15 mg/L或以上浓度时，可以完全抑制芽的分化，因此可以作为转化细胞筛选浓度。300 mg/L的头孢霉素抑菌效果相对较好，对芽分化的影响最小。张智俊等[24]的结论表明，75 mg/L的Kan可以作为筛选转化体和非转化体的临界浓度，而Amp的抑菌浓度为200~400 mg/L。

2.5 其他添加物

李建勇等[23]在共培养培养基中加入20 mg/L的乙酰丁香酮（AS）显著提高了西瓜子叶外植体的转化效率，转化率高达70%，远远高于没有加AS对照的转化率（20%）；张志忠等[22]在共培养培养基中添加AS可明显提高转化效率，最高达74.8%，而在其他条件类似情况下不经此处理的转化率仅为46.6%。由此可见，转化过程中使用AS对提高转化率是有益的。

目前关于AgNO3在组织培养和转化中的作用机理有3种解释，一些研究认为，AgNO3是乙烯作用的抑制剂，它能通过促进多胺的合成提高体细胞胚胎和芽发生的频率。Chi等认为AgNO3并不是抑制乙烯的合成，而是促进ACC合成酶活力和ACC的积累。另外还有研究认为Ag+在促进植株再生上与多胺代谢无关，Ag+抑制乙烯活性可能是通过竞争性结合细胞上的乙烯受体蛋白，起到阻止或降低乙烯的作用。

3 结语

植物病虫害生理小种变异比较迅速，很难用化学和物理方法防治，我们可以从广谱、持久的抗病基因方面入手，探索更有效的防治途径。另外我们可以尝试利用胚乳培养来产生三倍体，从根本上改进利用二倍体和四倍体杂交产生三倍体的育种手段。

目前大多数转基因工作仍停留在试验研究阶段，在生产中的应用还较少。另外转基因植物潜在的毒性和环境安全性是植物抗真菌基因工程推向市场的最大障碍。我们应该建立可靠的转基因植物毒性和环境安全风险性评价系统，对植物特别是作物抗病分子机理进行深入研究、完善转基因技术体系，使基因工程在作物种质创新、作物育种上得到更广泛的有效应用。

[1]冯凤娟，梁东，马锋旺，等.甜瓜叶片高效再生体系的建立[J].西北农业学报，2008，17（5）：321-324.

[2]褚剑峰，郑琪，林国美.西瓜和甜瓜的组织培养技术研究[J].安徽农业科学，2004，32（6）：1 169-1 170.

[3]Adelberg J W,Rhodes B B,Skorupska H T.Generating tetraploid watermelon and melon from tissue culture[J].Hort Science,1990,25(9):73.

[4]Galperin M,Patlis L,Ovadi A,et al.A melon genotype with superior competence for regeneration and transformation[J].International Journal of Dairy Technology,2003,122(1):66-69.

[5]Dong J Z,Yang M Z,Jia S R,et al.Transformation of melon(CucumismeloL.)and expression from the cauliflower mosaic virus 35S promoter in transgenic melon plants[J].Biotechnology,1991(9):858-862.

[6]黄永红，陶兴林，陆璐，等.甜瓜ACC氧化酶反义基因植物表达载体的构建及转化烟草的研究[J].西北植物学报，2005，25（2）：262-268.

[7]颜雪，赵惠新，王贤磊，等.甜瓜抗枯萎病基因表达载体的构建及其转化[J].生物技术，2008，18（3）：9-11.

[8]陶兴林，黄永红，赵长增，等.厚皮甜瓜品种离体培养再生植株能力的基因型差异研究[J].果树学报，2005，22（3）：252-255.

[9]潘俊松，蔡润，刘晓，等.甜瓜子叶节培养高效再生体系建立[J].上海交通大学学报：农业科学版，2003，21（4）：295-298.

[10]Galperin M,Zelcer A,Kenigsbuch D.High competence for adventitious regeneration in the BU-21/3 melon genotypeis controlled by a single dominant locus[J].Hort Science,2003(6):1 167-1 168.

[11]孙治图，许勇，张海英，等.西瓜离体再生高效基因型材料的筛选[J].中国瓜菜，2008（3）：5-9.

[12]白婧，屈淑平，崔崇士.瓜类蔬菜组织培养与遗传转化研究进展[J].中国瓜菜，2008（4）：33-37.

[13]王果萍.西瓜高效组织培养技术体系研究[J].中国西瓜甜瓜，2002（2）：1-3.

[14]李娟，张丽，李焕秀，等.西瓜花药培养技术研究[J].中国瓜菜，2008（4）：8-10.

[15]马国斌，王鸣.西瓜和甜瓜组织培养中外植体的极性现象和敏感部位[J].果树科学，1999，16（3）：232-234.

[16]王春霞，简志英.“京欣1号”西瓜子叶组织培养的研究[J].园艺学报，1996，23（4）：401-403.

[17]于喜艳，何启伟.甜瓜子叶组织培养的研究[J].山东农业科学，2002（2）：22-23.

[18]邓向东，耿玉轩.外植体和培养因子对哈密瓜不定芽诱导的影响[J].园艺学报，1996，23（1）：57-61.

[19]曹华兴，顾永强，何小华.激素在西瓜组织培养中对不定芽发生的影响[J].上海农学院学报，1986，4（4）：280-283.

[20]Fang G,Grumet R.Agrobacterium tumefaciens mediated transformation and regeneration of muskmelon plants[J].Plant Cell Rep，1990,9(3):160-164.

[21]王慧中，李亚南，赵培洁.根癌农杆菌介导的甜瓜基因转化及其转基因植株的再生[J].浙江大学学报：农业与生命科学版，2000，26（3）：287-290.

[22]张志忠，吴菁华，吕柳新.西瓜高频再生系统研究[J].中国农学通报，2004，20（2）：151-153.

[23]李建勇，丁淑丽，孙利祥，等.影响西瓜农杆菌介导的高效遗传转化效率的主要因子[J].浙江农业学报，2007，19（3）：197-201.

[24]张智俊，罗叔萍.抗生素对甜瓜植株再生的影响[J].中国西瓜甜瓜，2002（1）：6-7.

[25]王光林，方宏筠.植物基因工程[M].北京：科学出版社，2002.