复方紫草抗氧化剂的毒性初步评价

张凤清

(长春工业大学化学与生命科学学院，吉林 长春 130012)

复方紫草抗氧化剂的毒性初步评价

张凤清

(长春工业大学化学与生命科学学院，吉林 长春 130012)

以乙醇提取法获得紫草提取物(Z)和甘草提取物(G)，以碱提酸沉法获得槐米提取物(H)，再辅以柠檬酸(N)和VE(E)，按Z:G:H:N:E为10:5:5:2:1的比例复配成复方紫草抗氧化剂(FZK)。以FZK为受试物，通过小鼠经口急性毒性实验、小鼠骨髓细胞微核实验、小鼠骨髓细胞染色体畸变实验等毒理学实验对FZK的毒性进行了评价。结果表明：小鼠经口最大耐受剂量均大于16000mg/kg bw，FZK急性毒性分级为无毒级。剂量小于8000mg/kg bw条件下，FZK对小鼠嗜多染红细胞微核率无促提高作用，对小鼠骨髓细胞染色体无致畸作用。该食品添加剂不存在致突变性。

紫草；甘草；槐米；毒理学；安全

紫草、甘草、槐米是我国传统中药，甘草、槐米被我国列为药食兼用植物和天然食品抗氧化剂，紫草提取物紫草素被我国列为天然食品着色剂[1]。紫草素属于萘醌类化合物，分子结构上含有对位酚羟基，甘草的化学成分中含有甘草苷等100多种黄酮类化合物，槐米的主要化学成分是芦丁，紫草、甘草、槐米、V E因酚羟基的存在而表现出较强的抗氧化能力[2-4]。甘草和紫草还有较强的抗菌活性[2]。 前期实验利用正交试验对复方紫草抗氧化剂(FZK)的配方进行了优选，对FZK的抗氧化性能、抑菌效果进行了表征，结果表明，该抗氧化抑菌剂完全可以作为天然功能型食品添加剂而开发应用[5-6]。

国内学者对紫草、甘草及其提取物的毒性进行了初步研究[7-13]，有学者报道了新疆软紫草的乙醇提取物对昆明种小鼠的最大耐受剂量为19.5g/kg bw，但是中药紫草的水煎物以1.0g/kg bw剂量作用于小鼠时，具有潜在遗传毒性。将甘草提取物加入到润喉糖中，未见有致突变作用。甘草与麦冬和三参对哺乳动物遗传物质不具有损伤效应。但是，作为传统中药来说其低毒、无毒是相对的，从毒理学方面来考虑，从这些植物中提取有效成分并配伍使用已不同传统意义上的单味中药。国内外对紫草、甘草、槐米的混合提取物进行毒性评价未见报道。所以将这些提取物复配并作为食品抗氧保鲜剂来使用时，对其进行毒理学安全性评价具有重要意义。本研究进行急性毒性实验、小鼠骨髓细胞微核实验、小鼠骨髓细胞染色体畸变实验等毒性实验研究，以考察FZK中各混合物交互作用的安全性。同时，为下阶段亚慢性毒性实验和慢性毒性实验的染毒途径和剂量

选择提供依据。研究为复方紫草抗氧化剂的开发应用提供毒理学方面科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

ICR小鼠，SPF级，体质量(20±2)g，来自吉林大学基础医学院实验动物中心，饮水为自来水，灌胃前动物禁食14h。

紫草、甘草、槐米购自北京同仁堂长春市分店。由长春市药品检验所鉴定为合格原料药。其中紫草产自新疆，甘草产自内蒙古，槐米产自山东，三种药材均为道地药材。

注射用环磷酰胺(0.2g/支) 山西普德药业有限公司； 羧甲基纤维素钠(分析纯) 河南省华发科技有限责任公司；小牛血清(100mL/瓶) 上海锐聪科技发展有限公司；秋水仙素(1g/瓶) Sigma公司。

CHK-B145生物显微镜 日本Olympus 公司；TDZ5-WS离心机 湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司；DK-98-I恒温水浴锅 天津泰斯特仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 FZK提取工艺

紫草素提取工艺：紫草根→粉碎(过40目筛)→乙醇回流浸提→抽滤→滤渣回流提取2次→合并滤液→旋转蒸发浓缩(加入溶液体积1/3的 2g/100mL NaOH溶液使提取液由紫红色变为蓝色)→过滤→滤液(加浓盐酸至不再产生沉淀)→过滤→沉淀(水洗至中性，60℃以下干燥)→紫草素粗品。

紫草素乙醇提取条件：乙醇体积分数：75%；温度：80℃；热回流时间：40min；料液比：1:6(m/V)。

甘草苷提取工艺：甘草→粉碎(过40目筛)→乙醇回流浸提→抽滤→滤渣回流提取2次→合并滤液→旋转蒸发浓缩→喷雾干燥→甘草苷粗品。

甘草苷乙醇提取条件：乙醇体积分数：75%；温度：60℃；热回流时间：60min；料液比：1:10(m/V)。

芦丁提取工艺：槐米→粉碎(过40目筛)→水煮→抽滤→滤渣重复提取2次→合并滤液→调pH值→静置→抽滤→水洗、干燥→芦丁粗品。

水煎煮条件：6倍水、硼砂适量，煮沸加石灰乳至pH8～9，微沸30min。调pH值：60～70℃下，用浓度为12mol/L的盐酸调pH5左右。水洗至中性，60℃干燥。

1.2.2 FZK的配制

将紫草提取物、甘草提取物、槐米提取物作为FZK的主料并按2:1:1的比例混合，柠檬酸和VE作为FZK的辅料并按2:1混合，分别称取主料混合物200g和辅料30g并混合均匀，加入适量70%乙醇稀释，喷雾干燥。工艺参数：进风温度：115～140℃，出风温度：90℃左右，风机转数：1400r/min，工作压力：0.23～0.25MPa。

1.2.3 急性毒性实验[14]

因为受试物FZK不溶于水，采用2g/100mL甲基纤维素钠溶液作为分散剂，预实验结果表明动物的接受剂量超过15000mg/kg bw，因此检测了FZK的最大耐受剂量。20只ICR小鼠，雌雄各10只，按最大受试物分散度，最大限量法灌胃2次，每次间隔2h，给药剂量为每次16000mg/kg bw，给药后雌雄分笼正常饲养。

1.2.4 小鼠骨髓细胞微核实验和骨髓细胞染色体畸变实验

1.2.4.1 分组及给药剂量

小鼠骨髓细胞微核实验和骨髓细胞染色体畸变实验各ICR小鼠50只，分为5组，每组10只，雌雄各半。采用二次经口灌胃给药，每次间隔24h。由于未测出样品的LD50，故按动物最大耐受剂量的1/2、1/4、1/8分别设8000、4000、2000mg/kg bw 3个剂量组，另设阴性对照组和环磷酰胺阳性对照组，阴性对照组给予同等容量的生理盐水，阳性对照组给予环磷酰胺400mg/kg bw。

1.2.4.2 小鼠骨髓细胞微核实验

末次给药6h，脱颈处死动物，取胸骨骨髓用小牛血清稀释涂片，用Giemsa染色。

1.2.4.3 小鼠骨髓细胞染色体畸变实验

末次给药24h，脱颈处死动物。动物处死前4h，腹腔注射秋水仙素(8mg/kg bw)。取股骨骨髓经低渗、固定、滴片、Gi emsa染色。

1.2.5 指标检测

1.2.5.1 最大耐受剂量

染毒后观察动物的一般状态、体质量变化、中毒症状和死亡情况，观察期限为14h。

1.2.5.2 小鼠骨髓细胞微核率

在光学显微镜下，每只动物计数1000个嗜多染红细胞(PCE)，微核率以含微核的嗜多染红细胞千分率计。

1.2.5.3 染色体畸变百分率

在光学显微镜下，每只动物观察100个中期分裂相，计数染色体畸变百分率。

1.2.6 统计学处理

采用SPSS软件进行统计学处理。用单因素方差分析ANOVA，以Duncans多重比较检验。实验结果以均值±标准误差表示，采用组间t检验，P＜0.05时具有显著性差异，P＞0.05时无显著性差异。

2 结果与分析

2.1 受试物对小鼠急性经口急性毒性

灌胃后实验动物活动自如，状态良好，饮食正常，未见异常表现与死亡。实验结果见表1。

表1 受试物对小鼠急性经口毒性实验结果Table 1 Acute toxicity test results of FZK in mice

由表1可见，雌、雄性小鼠对FGK经口最大耐受剂量均大于16000mg/kg bw，FZK的急性毒性分级为无毒级。

2.2 受试物对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率的影响

表2 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率的影响Table 2 Effect of FZK on micronucleus rate of bone marrow cells in mice

如表2所示，该受试物各剂量组小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率未见明显增加，与阴性对照组比较无显著性差异(P＞0.05)，而环磷酰胺阳性对照组与剂量组比较，有非常显著性差异(P＜0.05)，说明该剂量条件下，受试物对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率无促提高作用。

2.3 受试物对小鼠骨髓细胞染色体畸变率的影响

表3 受试物对小鼠骨髓细胞染色体畸变率的影响Table 3 Effect of FZK on chromosomal aberration rate of bone marrow cells in mice

如表3所示，各剂量组、阴性对照组小鼠骨髓细胞染色体畸变细胞数与阳性组比较，数量明显降低，差异有显著性(P＜0.05)。而各剂量组与阴性对照组比较以及各剂量组之间比较，差异无显著性(P＞0.05)。表明该剂量条件下未见到受试物对小鼠骨髓细胞染色体的致畸作用。

3 讨 论

本研究是以紫草提取物、甘草提取物、槐米提取物再辅以柠檬酸和V E而制备了复方紫草抗氧化剂(FZK)，并对其急性毒性和致突变性进行研究。由于FZK的动物可耐受剂量大，达到15000mg/kg bw 的剂量下实验动物未出现死亡情况，因此，急性毒性实验中检测了最大耐受剂量。微核实验是70年代初期建立的一种利用哺乳动物骨髓细胞染色体改变来测定致突变作用的实验方法。由于小鼠骨髓嗜多染性红细胞(PCE)微核实验法具有简便快速等优点，已广泛应用于电离辐射、环境致突变剂等的研究。微核实验和染色体畸变实验目前已被公认为筛选致突变性的主要方法之一。环磷酰胺是一种烷化剂，可引起基因突变和染色体畸变，环磷酰胺诱导DNA损伤可导致细胞周期混乱和特定细胞群体中的细胞死亡[15]，因此常用环磷酰胺作为致突变性实验的阳性对照药。

甘草提取物LD50＞10g/kg bw(大鼠，经口)，紫草LD50＞4.46g/kg bw(小鼠，经口)。Amese实验、小鼠骨髓细胞微核实验、小鼠骨髓细胞染色体畸变实验，均未发现致突变作用[1]。表明这些中草药及其提取物作为食品添加剂具有无毒、抗氧化、抑菌等优点。本研究是以紫草提取物、甘草提取物、槐米提取物的混合物为受试物对象，急性毒性实验、遗传毒性实验结果均未发现各种化合物交互作用毒性增强。

FZK作为这些中草药的复方制剂小鼠经口最大耐受剂量大于16000mg/kg bw，毒性分级为无毒级，小鼠在最高剂量(8000mg/kg bw)为人可能摄取量的20000倍情况下遗传毒性实验未发生致突变现象。表明复方紫草抗氧化剂同样具有较高的安全性，作为天然功能型食品添加剂有着广阔的应用前景。

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Preparation and Toxicity Evaluation of Compound Lithospermum Antioxidant

ZHANG Feng-qing
(School of Chemistry and Life Science, Changchun University of Technology, Changchun 130012, China)

A compound Lithospermum antioxidant (FZK) was prepared using Lithospermum ethanol extract (Z), licorice ethanol extract (G), Sophora japonica extraction (H) from alkali extraction and acid precipitation, citric acid (N) and vitamin E (E) by the ratio of 10:5:5:2:1 (Z:G:H:N:E). The toxicity of FZK was evaluated by acute toxicity test, micronucleus test of bone marrow cells in mice, and chromosomal aberration test of bone marrow cells. Results indicated that the maximum tolerance dose of oral administration in mice was 16000 mg/kg body weight. According to acute toxicity classification criteria, FZK is non-toxic. However, FZK didn, t exhibit a role in improving micronucleus rate of polychromatic erythrocyte and the mutagenicity in mice at the dose of less than 8000 mg/kg body weight.

Lithospermum；licorice；bud of Sophora japonica；toxicology；safe

TS202.3

A

1002-6630(2010)23-0380-03

2010-08-19

吉林省科技发展计划项目(20065027)

张凤清(1967— )，女，副教授，硕士，研究方向为天然产物抗氧保鲜特性。E-mail：zfq671025@163.com