生物富硒对沼泽红假单胞菌G3菌株营养组分的影响

杨启银，刘淑超，贾秉晟，王家芳，曩潇潇

(1.南京师范大学生命科学学院，江苏 南京 210046； 2.南京市微生物工程技术研究中心，江苏 南京 210046；3.江苏省微生物资源工程化技术研究中心，江苏 南京 210046；4.南京红太阳集团，江苏 南京 210031)

生物富硒对沼泽红假单胞菌G3菌株营养组分的影响

杨启银1,2,3，刘淑超1，贾秉晟1，王家芳1，曩潇潇4

(1.南京师范大学生命科学学院，江苏 南京 210046； 2.南京市微生物工程技术研究中心，江苏 南京 210046；3.江苏省微生物资源工程化技术研究中心，江苏 南京 210046；4.南京红太阳集团，江苏 南京 210031)

为了探讨生物富硒对沼泽红假单胞菌的营养品质的影响，对富硒沼泽红假单胞菌G3菌株和普通沼泽红假单胞菌的一般营养成分、氨基酸、B族维生素、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)进行测定。结果表明：富硒培养的沼泽红假单胞菌总硒含量为875.03μg/g，其中有机硒含量为847.42μg/g，有机硒转化率为96.85%。富硒沼泽红假单胞菌G3菌株的蛋白质、菌体可溶性糖和粗脂肪的含量分别比普通沼泽红假单胞菌提高了9.10%、5.13%和42.86%，灰分含量则比普通菌降低了23.73%。富硒沼泽红假单胞菌菌体含有17种氨基酸，普通菌体含有16种氨基酸，富硒沼泽红假单胞菌菌体的多种氨基酸含量均高于普通菌，其中人体必需的蛋氨酸和赖氨酸分别比对照提高了100%和9.2%。富硒沼泽红假单胞菌的VB2、VB6、烟酸和类胡萝卜素与对照组相比均明显提高，VB2的含量提高了6.45%，VB6的含量提高了5.77%，烟酸的含量提高了7.20%，类胡萝卜素含量提高了45.08%，VB1与对照组相比下降了9.2%，富硒沼泽红假单胞菌菌体的SOD酶和CAT酶活性明显提高，分别比普通菌高158.43%和54.51%。

生物富硒；沼泽红假单胞菌；营养成分；评价

硒是人体和动物必需的一种微量元素，具有多种特殊的生理功能，在1957年Schwarz等[1]证实硒能够防止大鼠肝坏死，也能促进动物生长，并把它列为一种必需的生命元素。在此之前，人们对硒的研究一直只注

重它的毒害作用。直到1975年，Awasthi等[2]才首次明确指出，硒是人体必需的微量元素。近年来，研究发现硒是人体GPX(谷胱甘肽过氧化物酶)家族硒蛋白P和硒蛋白W的重要组成部分，在人体中发挥重要生理功能，具有预防心脑血管疾病、抗肿瘤、提高免疫、促进人体生长发育等作用[3-6]。当饮水、动物饲料及环境中硒含量过低时，人和动物就会出现硒缺乏症[5-6]。为了解决这一问题，最有效的方法就是补充适量的硒。许多研究表明[7-13]，相对于无机硒，生物源有机硒具有吸收利用率高、生物活性强、毒性低、环境污染小等优点，所以，生物富硒的研究日益受到重视。

沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)是光合细菌的代表菌株之一，分布于水田、池塘、湖泊等，被广泛应用于农业、畜牧业、渔业、环保、保健食品和医药等领域[14-16]。沼泽红假单胞的蛋白质和氨基酸含量较高，是一种优质蛋白源，同时还含有多种生物活性物质、B族维生素以及16种人体必需氨基酸等，具有很高的营养价值[17-18]。本实验室在对沼泽红假单胞菌的研究中发现，菌体在生长过程中有很强的转化有机硒的能力。本研究通过分析富硒沼泽红假单胞菌G3菌的营养成分，为富硒沼泽红假单胞菌G3菌的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris G3由本实验室分离保存，富硒沼泽红假单胞菌G3由本实验室制备。

邻苯二胺、磷酸、盐酸、硫酸、无水乙酸钠、无水乙醇、甲苯、石油醚、丙酮等均为分析纯；亚硒酸钠为试剂级；乙腈、甲醇为色谱纯；β-胡萝卜素标品 德国Merk公司。

1.2 仪器与设备

SKD-200凯氏定氮仪 上海沛欧分析仪器有限公司；A200氨基酸自动分析仪 德国安米诺公司；Waters 201DC型高效液相色谱仪 美国沃特斯科技(上海)有限公司；UV-2802S紫外分光光度计 上海洪富仪器仪表有限公司；Sigma-30K高速冷冻离心机 美国奥博塔科技(北京)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 沼泽红假单胞菌耐硒能力的驯化[19]

挑取活化后的沼泽红假单胞菌G3菌株单菌落，在添加亚硒酸钠分别为10-5、10-4、10-3、10-2mol/L的固体培养基平板上划线，对沼泽红假单胞菌G3菌株进行硒浓度梯度驯化。每次都挑取长得大且好的单菌落到含有更高浓度亚硒酸钠的平板上，直到无法生长。重复2～ 3次，挑取具有最高耐受量的单菌落于无硒平板上划线分离，30℃光照培养，由此得到可正常生长的耐硒菌株。当培养基中亚硒酸钠浓度达到10-2mol/L时，菌体无法生长，因此从亚硒酸钠浓度为10-3mol/L的平板上挑取单菌落于无硒平板中划线分离，置于30℃光照培养，得到可正常生长的耐硒菌株。

1.3.2 富硒沼泽红假单胞菌硒含量的测定

参照魏彩霞等[20]的方法测定。

1.3.3 硒标准曲线的绘制

吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL硒标准液于三角瓶中，配制硒质量浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μg/mL的溶液，以OD335nm为横坐标，硒质量浓度(μg/mL)为纵坐标，绘制标准曲线。得出硒含量标准曲线的回归方程为Y=0.1721X＋0.0021 (R2＝0.9996)。

1.3.4 有机硒含量及转化率

1.3.5 营养成分测定

灰分测定：550℃干法灰化法；蛋白质测定：凯氏定氮法；粗脂肪测定：索氏抽提法；可溶性糖测定：DNS法；氨基酸测定：HPLC法；VB1、VB2和烟酸的测定：HPLC法；类胡萝卜素测定：紫外分光光度法；标准曲线绘制及样品处理参照朱秀灵等[21]的方法。

1.3.6 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定

蛋白质含量测定采用Bradford[22]的方法，以BSA为标准蛋白，SOD酶比活力以U/mg pro表示。

1.3.7 过氧化氢酶(CAT)活性测定

参照徐镜波等[23]的方法，酶活以100s内使过氧化氢分解一半时的酶蛋白量表示。

2 结果与分析

2.1 亚硒酸钠浓度对沼泽红假单胞菌G3生长的影响

图1 亚硒酸钠浓度对G3菌生长的影响Fig.1 Effect of Na2SeO3concentration on the growth ofRhodopseudomonas palustrisG3

由图1可知，沼泽红假单胞菌G3菌株经驯化后，对亚硒酸钠的耐受性有了很大的提高，当亚硒酸钠浓度在4×10-5mol/L以下时，对沼泽红假单胞菌G3菌株的生长基本没有影响，在适宜的浓度下，对沼泽红假单胞菌G3菌株的生长有促进作用，在5×10-5mol/L浓度时对菌株生长略有影响。因此，4×10-5mol/L为富硒培养的理想浓度。

表1 富硒G3菌硒含量Table 1 Content of Se in selenium-enrichedRhodopseudomonas palustrisG3

由表1可知，经富硒培养的沼泽红假单胞菌总硒含量为875.03μg/g，其中有机硒含量为847.42μg/g，有机硒转化率为96.85%。

2.2 硒对沼泽红假单胞菌G3菌株一般营养成分的影响

表2 富硒G3菌和普通对照菌主要营养成分的比较Table 2 Comparison of major nutritional components in Se-enriched and normalRhodopseudomonas palustrisG3%

由表2可知，粗蛋白、可溶性糖类和粗脂肪，实验组与对照组比较分别提高了9.10%、5.13%、42.86%，而粗灰分含量，处理组减少了23.73%。

2.3 硒对沼泽红假单胞菌G3菌株氨基酸含量的影响

表4 沼泽红假单胞菌和富硒沼泽红假单胞菌G3菌株维生素含量的分析Table 4 Analysis of vitamin content in Se-enriched and normalRhodopseudomonas palustrisG3μg/g

表3 沼泽红假单胞菌和富硒沼泽红假单胞菌G3菌株氨基酸成分分析Table 3 Amino acid analysis of Se-enriched and normalRhodopseudomonas palustrisG3%

表5 G3菌株菌体SOD酶活和CAT酶活测定的结果Table 5 Activities of SOD and CAT in Se-enriched and normalRhodopseudomonas palustrisG3

由表3可知，除色氨酸和胱氨酸因含量不高水解时被破坏未检测出外，对照组中蛋白质含16种氨基酸，总氨基酸含量为87.94%，必需氨基酸总含量为36.98%，占总氨基酸含量的42.05%；必需氨基酸中亮氨酸含量最高，占总氨基酸的6.84%，胱氨酸未检测到；非必需氨基酸总含量为50.96%，占总氨基酸含量的57.95%，其中谷氨酸含量最高，为10.05%，组氨酸最低，含量为1.66%。实验组菌体蛋白质含17种氨基酸，总氨基酸含量达96.77%，必需氨基酸总含量为39.13%，占总氨基酸含量的40.44%，其中亮氨酸含量最高，占总氨基酸的7.36%；非必需氨基酸总含量为57.64%，占总氨基酸含量的59.56%，其中谷氨酸含量最高，占总氨基酸的11.5%，胱氨酸含量最低，占总氨基酸的1.1%。实验组总氨基酸较对照组提高了10.04%，必需氨基酸含量较对照组提高了5.81%，非必需氨基酸含量较对照组提高了13.11%。

实验组的天门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸和精氨酸均高于对照组，其中人体必需的8种氨基酸中，实验组的亮氨酸、蛋氨酸和赖氨酸均明显高于对照组，分别提高了7.6%、100%和9.2%；比较实验组与对照组的异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸、组氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸的含量，二者没有差异。

2.4 硒对沼泽红假单胞菌G3菌株B族维生素和类胡萝卜素含量的影响

由表4可知，沼泽红假单胞菌的B族维生素十分丰富，实验组的VB2、VB6、烟酸和类胡萝卜素均高于对照组，VB2、VB6、烟酸和类胡萝卜素分别提高了6.45%、5.77%、7.20%和45.08%，类胡萝卜素的提高尤为明显；实验组VB1含量比对照组下降了9.2%。2.5硒对沼泽红假单胞菌G3菌株SOD酶活和CAT酶活性的影响

由表5可知，实验组和对照组的蛋白含量、SOD

酶活和CAT酶活都比较高，实验组的蛋白含量、SOD酶活和CAT酶活分别为0.39μg/μL、2.30U/μg、8.90U/μg，与对照组比较，分别提高了34.48%、158.43%和54.51%。

3 讨论与结论

3.1 本实验结果表明，沼泽红假单胞菌G3菌株在硒浓度为4×10-5mol/L的条件下，经硒胁迫驯化培养总硒含量可达875.03μg/g[13]，其中无机硒含量27.61μg/g、有机硒含量为847.42μg/g、有机硒转化率为96.85%。硒处理G3菌的营养组分也发生了变化，蛋白质提高了9.10%、可溶性糖含量提高了5.13%、脂肪含量提高了42.86%，粗灰分下降了23.73%。对照组的粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分的检测结果与庄传东等[18]对沼泽红假单胞菌营养成分分析结果基本一致；实验组的粗脂肪和粗灰分的实验结果与庄传东等[18]对粗脂肪和粗灰分的检测结果有明显差别。本实验中实验组粗脂肪含量高于对照组，与李志勇等[12]报道的富硒螺旋藻脂肪含量低于普通螺旋藻不一致，这可能是由于不同生物体的富硒途径不同，富硒沼泽红假单胞菌G3菌对脂的积累与合成有促进作用，具体机制有待进一步研究。

3.2 硒实验组主要营养组分检测结果表明：硒实验组的蛋白质含有17种氨基酸，总氨基酸含量达96.77%，必需氨基酸总量为39.13%，非必需氨基酸总量为57.64%，必需氨基酸占总氨基酸含量的40.44%，非必需氨基酸占总氨基酸含量的59.56%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值(E/N)为0.68。对照组菌体的蛋白质含有16种氨基酸，总氨基酸含量达87.94%，必需氨基酸总量为36.98%，非必须氨基酸50.96%，必需氨基酸占总氨基酸含量的42.05%，非必需氨基酸占总氨基酸含量的57.95%，E/N为0.73。根据FAO/WHO对饲料蛋白的理想模式[17-18,23]，质量较优的蛋白质氨基酸组成，必需氨基酸含量(E)应在40%～60%，E/N在0.6以上[24]，实验组的E/N为0.68，对照组的E/N为0.73，其比值均超过了0.6。这与庄传东等[18]对沼泽红假单胞菌的氨基酸成分分析结果基本一致。

3.3 比较了硒实验组G3菌和对照组G3菌的粗蛋白含量：硒实验组G3菌为66.80%，对照组G3菌为61.23%，硒G3菌提高了9.1%。因此，可以认为硒实验组G3菌和沼泽红假单胞菌G3菌都是一种营养组分较为齐全的蛋白原料，经硒处理的G3菌更是一种具开发价值的优质原料。

3.4 硒实验组G3菌的天门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸和精氨酸均高于对照组，其中蛋氨酸和赖氨酸差异明显，分别提高了100%和9.2%，而其余氨基酸与对照组没有差异，由于蛋氨酸和胱氨酸是含硫氨基酸，这两类氨基酸与硒在体内的转化代谢密切相关。因为硒和硫属于同一主族，性质相似，硒在体内代谢的途径往往是沿着硫代谢的途径进行，具有相同的酶体系，取代含硫氨基酸中的硫，生成硒代氨基酸，以硒代半胱氨酸的形式特异性地与蛋白结合，或以硒代蛋氨酸的形式非特异性地与蛋白结合[14]。因此在适宜的硒浓度下，无机硒进入菌体，转化为有机硒，参与菌体的生长和代谢，存在使蛋白质含量增加的可能性，添加适量的硒可以增加菌体蛋白质中氨基酸的总量。这与胡文军等[11]报道的添加一定量的硒，菌体能合成高含量的蛋白质的结果相一致。但胱氨酸的分析与吴向华等[17]报道的结果不同，这可能是培养条件和检测仪器及方法不同所致，其原因有待进一步研究。

3.5 与其他生物相比，沼泽红假单胞菌G3菌的B族维生素和类胡萝卜素的含量要高得多，经硒处理的G3菌B族维生素更为丰富，VB2、VB6、烟酸的含量分别为57.80、22.72、32.18μg/g ，与对照相比提高了6.45%、5.77%、7.20%；类胡萝卜素为1293.24μg/g，与对照相比提高了45.08%；说明硒对菌体B族维生素和类胡萝卜素的合成有影响，此实验结果与吴向华等[17]对沼泽红假单胞菌的B族维生素和类胡萝卜素检测基本一致。B族维生素是各种酶的活性基的组成部分，与核酸的合成有密切关系，能参与动物生长发育、有机体神经代谢、氨基酸代谢和脂肪代谢[25]；类胡萝卜素和β-胡萝卜素都具有抗氧化作用，是人和动物需要的生物活性物质，在食品、医学和饲料等领域都有广泛应用。实验发现，实验组VB10.76μg/g，对照组VB10.83μg/g，实验组反而比对照下降了9.2%，具体原因有待进一步研究。3.6本实验对SOD酶和CAT酶检测发现，硒实验组G3菌较沼泽红假单胞菌G3菌均有明显提高，SOD酶活性提高了158.43%，CAT酶活性提高了54.51%，硒实验组的这两种酶活如此之高，可能是硒诱导和促进了SOD酶活和CAT酶活的产生，因为抗氧化性是硒的生化作用基础[7]，说明硒能对沼泽红假单胞菌的生长和代谢产生影响。

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Effect of Selenium Enrichment on Nutritional Composition of Rhodopseudomonas palustris G3

YANG Qi-yin1,2,3，LIU Shu-chao1，JIA Bing-sheng1，WANG Jia-fang1，NANG Xiao-xiao4
(1. College of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China；2. Nanjing Engineering and Technology Research Center for Microbiology, Nanjing 210046, China；3. Jiangsu Engineering and Technology Research Center for Microbial Resources, Nanjing 210046, China；4. Nanjing Redsun Co. Ltd., Nanjing 210031, China)

In order to explore the effect of selenium enrichment on nutritional compositions of Rhodopseudomonas palustris, general nutrients, amino acids, vitamin B family, nicotinic acid, β-caroteneare, superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) in selenium-enriched Rhodopseudomonas palustris (sRP) and normal Rhodopseudomonas palustris (nRP) were compared. Results indicated that the contents of protein, soluble sugar and crude fat of sRP were higher than those of nRP, which exhibited an enhancement by 9.10%, 5.13% and 42.86%, respectively. Whereas, the ash content of sRP was lower than that of nRP with a decrease by 23.73%. In addition, totally 17 amino acids were detected in sRP, while only 16 amino acids was detected in nRP. Moreover, the contents of amino acids in sRP were much higher than those in nRP, especially for methionine and lysine with an increase by 100% and 9.2%, respectively. Vitamin B2, vitamin B6, nicotinic acid and carotenoid in sRP were 6.45%, 5.77%, 7.20% and 45.08%, which were also higher than those in nRP, respectively. However, the content of vitamin B1 in sRP was lower than nRP. The activities of SOD and CAT in sRP exhibited an enhancement of 158.43% and 54.51% when compared with those in nRP. Therefore, selenium-enrichment can improve nutritional quality of Rhodopseudomonas palustris.

selenium-enrichment；Rhodopseudomonas palustris；nutritional component；evaluation

TS202.3；Q939.112

A

1002-6630(2010)23-0253-05

2010-08-28

江苏省科学技术厅高技术研究计划项目(BG2005326)

杨启银(1951—)，男，副教授，主要从事微生物应用和微生物制剂研究。E-mail：yangqiyin@163.com