越橘果实花色苷的体外抗氧化性

吕春茂，王新现，包 静，孟宪军，董文轩*

(1.沈阳农业大学园艺学院，辽宁 沈阳 110866；2.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866)

越橘果实花色苷的体外抗氧化性

吕春茂1,2，王新现2，包 静2，孟宪军2，董文轩1,*

(1.沈阳农业大学园艺学院，辽宁 沈阳 110866；2.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866)

采用还原能力测定、清除羟自由基(·OH)能力、清除超氧阴离子自由基(O2·)能力和对DPPH自由基的抑制作用对高丛越橘蓝丰、半高丛越橘北春、矮丛越橘美登及野生品种越橘果实花色苷进行体外抗氧化活性研究，并测定其中花色苷含量。结果表明：花色苷粗品中蓝丰、北春、美登和野生越橘的花色苷含量依次为19.77、12.67、24.73、32.44mg/g；4种果实花色苷皆有良好的抗氧化活性，在溶液质量浓度相同的情况下，4种越橘果实花色苷溶液的抗氧化活性与花色苷含量呈一定的量效关系，野生越橘的还原能力、清除·OH能力、清除O2·能力和清除DPPH自由基能力均最高，矮丛越橘美登次之；而在花色苷含量相同的情况下，高丛越橘蓝丰、半高丛越橘北春、矮丛越橘美登及野生品种越橘果实的花色苷抗氧化活性不同，推测是由于其花色苷组分及其含量不同所致。

越橘；花色苷；抗氧化性

越橘(Bilberry)，又称蓝浆果、蓝莓果，属于杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium.SPP) 多年生落叶或常绿灌木，全世界广泛分布[1-2]。越橘果实中含有丰富的花色苷等多酚类物质，花色苷是一种天然的抗氧化剂，具有抗氧化、清除自由基等多种保健和营养功能[3-5]，它不仅抗氧化效果显著，且对人体无任何毒副作用，现对其开发应用受到越来越多的关注。杨桂霞[6]和李亚东等[7]均报道越橘不同品种间花色苷含量有很大的差别，但其抗氧化能力是否有差别鲜有报道。为充分利用越橘植物资源，本研究对3个栽培种和1个野生种越橘果实提取物进行花色苷含量测定，并对其体外抗氧化作用进行比较研究，旨在为越橘属功能性食品及天然抗氧化剂的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

越橘栽培品种蓝丰(Bluecrop，高丛越橘品种群)、北春(N o r t h c o u n t r y，半高丛越橘品种群)、美登(Blomidon，矮丛越橘品种群)和野生越橘(Vaccinium

uliginosum Linn.)果实于2009年6月分别采自沈阳农业科技开发园和长白山，冰袋冷藏运输，-20℃冷冻储藏。

NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、无水碳酸钠、没食子酸、蛋黄卵磷脂、抗坏血酸、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、硫酸亚铁、冰乙酸、三氯化铁、六氰合铁酸钾[K3Fe(CN)6]、Tris(三羟甲基氨基甲烷)、水杨酸、氢氧化钠、乙醇、盐酸、30%过氧化氢、三羟基氨基甲烷(Tris)、邻苯三酚，均为分析纯。

FD-IC-80真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；JY92-Ⅱ超声波细胞破碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；FW80-1高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；TU-1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；TDL-40B台式离心机 上海安亭科学仪器厂制造。

1.2 方法

1.2.1 越橘花色苷的制备

将越橘果实制成冻干粉，冻干粉经超声波辅助提取，提取液经减压浓缩，真空干燥得紫黑色花色苷粗品干粉。准确称取花色苷粗品0.1000g，用60%的乙醇溶液进行溶解并定溶至100mL，于冰箱中冷藏备用。另外准确称取抗坏血酸(VC)0.1000g，用60%的乙醇溶液溶解定溶至100mL容量瓶，制成越橘花色苷抗氧化性比较的对照液。于546nm波长处测定花色苷色素溶液的吸光度，花色苷含量计算公式[8]为：

式中，A为最大吸收峰位置处的吸光度；K为标准曲线斜率；V1为供试液体积/mL；V2为提取液总体积/mL；V3为吸取V2中用于检测的提取液体积/mL；m为样品的初质量/g。

1.2.2 越橘花色苷还原能力的测定

采用普鲁士蓝法[9-10]。分别准确移取1mL适当浓度的花色苷提取液和VC 溶液，依次加入2.5mL 0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.6)和2.5mL质量分数 1% 六氰合铁酸钾溶液(K3Fe(CN)6)，于50℃水浴保温20min后，快速冷却，再加入2.5mL质量分数10% 的三氯乙酸(TCA)，以3000r/min的转速离心10min，取上清液2.5mL，依次加入2.5mL蒸馏水，0.5mL 0.1%的三氯化铁溶液，充分混匀，静置10min后，在700nm波长处测定其吸光度。

1.2.3 越橘花色苷清除·OH能力的测定

参照Smirnoff等[11]的方法并略加改动。反应体系中含8.8mmol/L H2O21mL，10mmol/L FeSO41mL，10mmol/L水杨酸-乙醇1mL，分别移取1mL花色苷提取液和VC 溶液，加H2O2启动反应，37℃反应0.5h，以蒸馏水作参比，在510nm波长处测定各浓度的吸光度，按式(1)计算清除率。

式中：A0为对照液的吸光度；A1为加入花色苷溶液后的吸光度；A2为不加显色剂H2O2花色苷溶液的吸光度；抗坏血酸作阳性对照。

1.2.4 越橘花色苷O2·清除率的测定

1.2.4.1 邻苯三酚自氧化速率的测定[12-13]

取4.5mL pH 8.2的50mmol/L Tris-HCl缓冲液和4.2mL蒸馏水，混匀后在25℃恒温水浴中保温20min，取出后立即加入在25℃预热过的3mmol/L邻苯三酚溶液0.3mL，迅速摇匀后倒入比色杯，每隔0.5min在320nm波长处测定溶液的吸光度，计算线性范围内每分钟吸光度的增加(ΔA0)。

1.2.4.2 样品活性测定

取4.5mL pH 8.2的50mmol/L Tris-HCl缓冲液和3.3mL蒸馏水，混匀后在25℃恒温水浴中保温20min，取出后准确移入其中各待测液1mL，加入在25℃预热过的3mmol/L邻苯三酚溶液0.3mL，迅速摇匀后倒入比色杯，每隔0.5min在320nm波长处测定溶液的吸光度，计算线性范围内每分钟吸光度的增加(ΔA)，计算清除率。

式中：ΔA0为邻苯三酚自氧化速率；ΔA为加入越橘花色苷后邻苯三酚的自氧化速率，单位均为吸光度每分钟的增值。

1.2.5 越橘花色苷清除DPPH自由基能力的测定

参考Yamaguchi等[14]的方法并略作修改。称取0.1984g DPPH用无水乙醇溶解，定溶至50mL，作为储备液。吸取2 mL D P P H储备液，用无水乙醇定溶至100mL，待测。利用紫外-可见分光光度计法测定加抗氧化提取液后在波长517nm处吸收的下降表示其对有机自由基消除能力，按表2加反应液，测定吸光度，以70%乙醇作空白。

用力摇匀，将Ai所表示的样品在常温下避光反应30min后，加入1cm比色皿中进行吸光度的测定，测出A0、Ai、Aj的吸光度，按式(3)进行清除率的计算。

式中：吸光度A0为2mL DPPH溶液+2mL 70%乙醇；Ai为2mL DPPH溶液+2mL 样品溶液；Aj为2mL 70%乙醇+2mL样品溶液。

1.2.6 统计分析

所有试验均重复3次，结果表示为平均值±标准偏差。应用SPSS11.5软件对数据进行方差分析，并进行Duncans’差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 越橘果实花色苷含量

4种越橘果实花色苷粗品溶液(1mg/mL)的花色苷含量比较见图1。野生越橘的花色苷含量明显高于3个越橘栽培品种，达32.44mg/g；在3个越橘栽培品种中，矮丛越橘美登的花色苷含量最高(24.73mg/g)，其次为高丛越橘蓝丰(19.77mg/g)，半高丛越橘北春的花色苷含量最低(12.67mg/g)，且这4个越橘品种间花色苷的含量差异显著(P＜0.05)。

图1 不同品种越橘果实花色苷含量的比较Fig.1 Anthocyanins content of different varieties of bilberry

2.2 越橘花色苷还原能力

图2 1mg/mL质量浓度下越橘果实花色苷粗品溶液还原能力的比较Fig.2 Comparison of reducing power of bilberry anthocyanins under the same mass concentration

由图2可知，在花色苷粗品溶液质量浓度相同情况下，VC的还原能力最强(差异显著，P＜0.05)，野生越橘和矮丛越橘美登次之，高丛越橘蓝丰和半高丛越橘北春最低。

图3为各越橘果实花色苷粗品溶液在花色苷含量相同情况下的还原能力比较。

图3 相同花色苷含量越橘果实花色苷还原能力的比较Fig.3 Comparison of reducing power of bilberry anthocyanins under the same anthocyanin content

由图3可见，高丛越橘蓝丰、半高丛越橘北春、矮丛越橘美登和野生越橘的还原能力差异不显著，且均低于VC的还原能力。

2.3 越橘花色苷清除·OH能力

图4 1mg/mL质量浓度越橘果实花色苷粗品溶液的·OH清除率比较Fig.4 Comparison of removing hydroxyl radical by bilberry anthocyanins under the same mass concentration

由图4可见，越橘花色苷具有良好的清除·OH能力，清除·OH能力的高低依次为：野生越橘＞矮丛越橘美登＞半高丛越橘北春＞高丛越橘蓝丰，其中野生越橘和矮丛越橘美登的花色苷粗品溶液对·OH的清除率均高于VC，且差异显著(P＜0.05)；半高丛越橘北春清除·OH的能力与VC相当，而高丛越橘蓝丰则低于V C。

图5 相同花色苷含量越橘果实花色苷的·OH清除率比较Fig.5 Comparison of removing hydroxyl radical of bilberry anthocyanins under the same anthocyanin content

由图5可知，在花色苷含量相同的情况下，4种果实花色苷溶液对·OH的清除率显著高于VC；其中半高丛越橘北春和高丛越橘蓝丰对·OH的清除能力相最

强，矮丛越橘美登次之，野生越橘最低，且差异显著(P＜0.05)。

2.4 越橘花色苷清除O2·能力

图6 1mg/mL质量浓度越橘果实花色苷粗品溶液的O2·清除率比较Fig.6 Effects of bilberry extract on O2·scavenging ability under the same mass concentration

由图6可知，不同越橘果实花色苷粗品溶液对O2·的清除能力相差很大(P＜0.05)，其中野生越橘果实花色苷对O2·的清除率最高，矮丛越橘美登次之，高丛越橘蓝丰最低；供试的4种越橘果实花色苷粗品溶液对O2·的清除率均低于VC。

图7 相同花色苷含量越橘果实花色苷的O2·清除率比较Fig.7 Effects of bilberry extract on O2· scavenging ability under the same anthocyanin content

由图7可知，供试的4种越橘果实花色苷粗品溶液对O2·的清除率均低于VC；矮丛越橘美登、半高丛越橘北春和野生越橘清除O2·的能力相近，显著高于高丛越橘蓝丰(P＜0.05)。

2.5 越橘花色苷DPPH自由基清除能力

图8 1mg/mL质量浓度越橘果实花色苷粗品溶液的DPPH自由基清除率比较Fig.8 Effects of bilberry extract on DPPH radical scavenging activity under the same mass concentration

由图8可知，在粗品溶液质量浓度相同情况下，野生越橘果实花色苷对DPPH自由基的清除率最高，且与VC相当，矮丛越橘美登次之，半高丛越橘北春最低。

在花色苷含量相同情况下各处理对DPPH自由基清除能力的比较结果见图9。

图9 相同花色苷含量越橘果实花色苷的DPPH自由基清除率比较Fig.9 Effects of bilberry extract on DPPH radical scavenging activity under the same anthocyanin content

由图9可知，半高丛越橘北春清除DPPH自由基的能力最强，显著高于VC(P＜0.05)，矮丛越橘美登、高丛越橘蓝丰和野生越橘清除DPPH自由基的能力与VC相当。

3 讨 论

越橘果实中含有丰富的花色苷，野生品种花色苷含量可达0.33～3.38g/100g鲜质量；栽培品种0.07～0.15 g/100g鲜质量[15]。近些年来国内对越橘花色苷含量的测定已有很多相关研究，研究表明不同品种间花色苷含量有很大的差别。本研究中，高丛越橘蓝丰、半高丛越橘北春、矮丛越橘美登及野生越橘果实花色苷粗品溶液中的花色苷含量亦不相同，且野生越橘果实的花色苷含量明显高于其他3个栽培品种，这与前人研究结果相似。

采用还原能力测定、清除·OH能力、清除O2·能力和清除DPPH自由基能力对高丛越橘蓝丰、半高丛越橘北春、矮丛越橘美登及野生越橘果实花色苷进行体外抗氧化活性研究。结果表明，4种越橘果实的花色苷溶液皆有良好的抗氧化活性。在粗品溶液质量浓度为1mg/mL时，野生越橘的还原能力、清除·OH能力、清除O2·能力和清除DPPH自由基能力均最高，美登次之，蓝丰和北春较低，总体上看4种越橘果实花色苷溶液的抗氧化活性与花色苷含量呈一定的量效关系。在花色苷含量相同的情况下，4 种越橘果实花色苷对DPPH自由基清除能力从高到低依次为北春、美登、蓝丰、野生越橘；还原能力从高到低依次为北春、蓝丰、美登、野生越橘；清除·OH能力从高到低依次为北春、蓝丰、美登、野生越橘；清除O2·能力从高到低依

次为美登、北春、野生越橘、蓝丰。由此可见，在花色苷粗品溶液质量浓度相同的情况下，由于高丛越橘蓝丰、半高丛越橘北春、矮丛越橘美登及野生越橘的果实中所含的花色苷含量不同，导致其抗氧化活性也不同，其中花色苷含量相对较高的野生越橘的抗氧化活性要强于其他3个栽培品种。在花色苷含量相同的情况下，高丛越橘蓝丰、半高丛越橘北春、矮丛越橘美登及野生越橘的果实花色苷抗氧化活性也不同，这可能是由于高丛越橘蓝丰、半高丛越橘北春、矮丛越橘美登及野生越橘的果实中花色苷组分及其含量不同所导致，越橘果实花色苷的组分及其抗氧化功效还有待于进一步研究。

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in vitro Antioxidant Evaluation of Anthocyanins from Bilberry Fruits

LU Chun-mao1,2，WANG Xin-xian2，BAO Jing2，MENG Xian-jun2，DONG Wen-xuan1,*
(1. College of Horticultural Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China；2. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

To take full advantage of the bilberry resources, DPPH, hydroxyl and superoxide anion free radical scavenging and reducing power assays were used to study the in vitro antioxidant activity of the fruits of cultivated bilberry varieties, including Lanfeng, Beichun, Meideng, and wild bilberry fruits. The contents of polyphenol and anthocyanins were also determined. The results showed that, the anthocyanin content of Lanfeng, Beichun, Meideng and wild bilberry were 19.77, 12.67, 24.73 mg/g and 32.44 mg/g frozen fruit, respectively, and anthocyanin had noticeable antioxidant activities. Among the four varieties of bilberry, the antioxidant activity of wild bilberry was the highest, followed by Meideng. The anthocyanins from the four varieties of bilberry had different antioxidant effects at the same concentrations. It is deduced that this is ascribed to the differences in anthocyanin composition and content.

bilberry；anthocyanins；antioxidant activities

TS255.1

A

1002-6630(2010)23-0027-05

2010-10-09

沈阳市青年人才基金计划项目(1081240-1-02)；沈阳农业大学博士后科研基金项目

吕春茂(1970—)，男，副教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：bt_lcm@126.com

*通信作者：董文轩(1963—)，男，教授，博士，研究方向为果树种子资源。E-mail：wxdong63@126.com