酱油曲霉发酵芝麻饼粕的条件优化

邵元龙， 董 英*

(江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013)

酱油曲霉发酵芝麻饼粕的条件优化

邵元龙， 董 英*

(江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013)

采用响应面法对酱油曲霉固体发酵芝麻饼粕提高抗氧化能力的条件进行优化。通过Plackett-Burman设计法，评价麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、麦麸、玉米浆、酵母膏和硫酸铵8个因素对清除DPPH自由基能力的影响。筛选出麦麸、葡萄糖和硫酸铵为影响芝麻饼粕发酵提取物抗氧化活性的3个显著因素，然后采用中心组合试验设计和响应面分析法，对3个关键因素进行优化。优化的发酵条件为：葡萄糖、硫酸铵和麦麸添加量分别为1.87%、1.54%和2.55%。在该实验条件下，DPPH自由基清除活性为80.26%。

芝麻饼粕；发酵；优化；抗氧化活性；酱油曲霉

在亚洲国家，芝麻广泛应用在各种传统食品中，并且是世界上重要的油料作物之一，我国2007年的产量已达到59万t。芝麻种子中除含有50%的油和25%的蛋白外，还含有丰富的具有生理活性的物质[1]。提油后的芝麻饼粕中蛋白含量进一步提高，部分具有活性的木脂素类物质也残留在芝麻饼粕中。这部分木脂素包括芝麻素、芝麻酚、芝麻林素、芝麻林素酚等[2]。他们在体内或体外具有不同的生理活性，如：抑制Δ 5去饱和酶[3]、保护肝脏[4]、降低胆固醇[5]、调节脂质代谢[6]。

国内外对芝麻饼粕中抗氧化物质的研究日趋深入[7-8]，如对芝麻素的提取工艺[9-10]、检测方法[11]的研究。单纯的分离和鉴定木脂素已不能满足未来对抗氧化剂的需求，应用现代生物技术方法来寻找新的抗氧化剂来源是较有前景的途径之一。2003年，日本的Ohtsuki等[12]用环状芽孢杆菌YUS-2液体发酵芝麻饼粕，发现两种新的具有更强抗氧化能力的物质。2005年，日本的Miyake等[13]采用Aspergillus分别发酵芝麻素和三糖基芝麻素酚，转化生成了更强抗氧化活性的木脂素类物质。

2007年，董英等[14]用酱油曲霉发酵芝麻饼粕，发现可以提高其抗氧化活性，但并未对发酵条件进行优化。因此，本实验选用酱油曲霉(Aspergillus soja e)对芝麻饼粕进行发酵，以抗氧化活性(DPPH自由基清除活性)为指标，对发酵条件进行优化，旨在为对发酵芝麻饼粕中抗氧化物质的提取、分析和转化机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

酱油曲霉(CICC2128) 中国工业微生物菌种保藏中心；芝麻饼粕 江苏镇江京友调味品公司。

二苯代苦味肼基自由基(2,2-d i p h e n y l-2-picrylhydrazyl，DPPH) 美国Sigma公司。

HH-S恒温水浴锅、JJ-1 型电动搅拌器 江苏金坛医疗仪器厂；LD5-10离心机 北京医用离心机厂；WFJ-72000可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司；YM50A电热蒸汽压力灭菌器 上海三申医疗器械有限公司；PSX智能型恒温恒湿培养箱 宁波来福科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Plackett-Burman试验设计

酱油曲霉接种于土豆汁(PDA)斜面培养基上，28℃培养72h后，加入10mL无菌生理盐水，用接种针刮下，调节菌液浓度为0.86×108CFU/mL。将粉碎的芝麻饼粕在烘箱中烘干，按料液比为1∶3(g/mL)的比例加入正己烷，45℃水浴搅拌3h，4000r/min离心10min，得脱脂芝麻饼粕。取10g烘干的脱脂芝麻饼粕加入9mL溶解有不同成分的溶液，于121℃灭菌20min，冷却后，接种1mL制备好的种子悬液，摇匀，于28℃条件下发酵144h。

根据酱油曲霉生长所需营养要素的基本原则和发酵影响因素的一般规律，结合文献[14]的报道和前期的实验，选用试验次数n=12的试验设计，对麦芽糖(A)、葡萄糖(B)、蔗糖(D)、果糖(E)、麦麸(G)、玉米浆(H)、酵母膏(K)和硫酸铵(L)8个因素进行考察，每个因素取两个水平，设计方案见表1，响应值为发酵提取液对DPPH自由基清除活性(radical scanvening activity，RSA)。另设 3个虚拟列，以考察实验误差。对实验结果进行分析，得出各因素的F值和可信度水平。一般选择可信度大于90%以上的因素作为重要因素。

表1 Plackett-Burman试验设计的因素水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experimental design

1.2.2 Box-Behnken试验设计

根据Plackett-Burman试验结果，选取酱油曲霉固体发酵芝麻饼粕提取液对DPPH自由基清除活性影响显著的外界因子：葡萄糖、麦麸和硫酸铵作为试验因素。试验中响应值为DPPH自由基清除活性，试验因素随机编码为：葡萄糖(X1)、硫酸铵(X2)和麦麸(X3)，试验因素及水平设计见表2，发酵条件与Plackett-Burman试验一致。

表2 Box-Behnken试验因素及水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3 发酵液的提取

发酵结束后，每瓶加入体积分数8 0%乙醇溶液75mL，50℃水浴搅拌提取2h，转速150r/min。上清液于5000r/min离心10min。沉淀按同样条件重复提取一次，合并上清液，定容至150mL。

1.4 DPPH自由基清除活性测定

取发酵提取液1mL，用体积分数50%的乙醇溶液稀释10倍，作为样品液。DPPH溶液浓度为7.5×10-6mol/L，波长517nm，50%乙醇溶液为对照。每个样品重复测定两次，求平均值。DPPH自由基清除活性(RSA)按下式计算：

式中： A0为5mL DPPH与1mL乙醇混合液的吸光度；Ai为5mL DPPH与1mL样品反应后的吸光度；Aj为5mL乙醇与1mL样品混合液的吸光度[15]。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman设计及结果

表3 Plackett-Burman试验设计与结果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

Plackett-Burman设计法是一种两水平的试验设计方法，它基于非完全平衡块原理，可以用最少试验次数估计出因素的主效应，适用于从众多的考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素，供进一步研究用。对试验结果进行分析，得出各因素的 F值和可信度水

平。一般选择可信度大于 90%以上的因素作为重要因素[16]。Plackett-Burman试验设计的试验结果见表3。

表4 Plackett-Burman试验设计结果相关系数和方差分析Table 4 Regression coefficients and variance analysis for the results of Plackett-Burman experiments

由表4各因素效应分析结果可知，经过酱油曲霉发酵后，葡萄糖、麦麸和硫酸铵3个因素对提取液清除DPPH自由基影响显著，可信度在90%以上，对此三因素进一步做响应面试验。而其他因素的取值则根据各因素效应的正负和大小，正效应的因素均取较高值，负效应的因素均取较低值。

2.2 Box-Behnken试验设计及结果

表5 Box-Behnken试验设计及结果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiments

Box-Behnken优化试验设计和结果见表5，利用Desig-Expert 7.0软件，对表5中数据回归拟合，获得Aspergillus发酵芝麻饼粕的提取物抗氧化能力对自变量葡萄糖、硫酸铵和麦麸的二次多项回归方程：

RSA/%=78.31＋2.22X1＋0.84X2＋2.27X3－0.39X1X2＋0.48X1X3＋0.32X2X3－1.77X12－2.76X22－2.06X32

模型方差分析见表6，试验所选用的二次多项模型具有高度的显著性(P=0.0229)，失拟项不显著(P=0.0569)，其校正系数R2=0.926，表明有约92.6%的抗氧化能力可由此模型进行解释。所以自由基清除率与预测值之间具有较好的拟合度，可用于Aspergillus固体发酵提高抗氧化能力的分析和预测。3个试验因素中X1和X3对发酵提取物清除DPPH自由基能力的影响极显著，而硫酸铵与各因素的交互作用皆不显著。

表6 Box-Behnken试验结果方差分析Table 6 Variance analysis of Box-Behnken experiments

2.3 响应面试验结果

图1 葡萄糖和硫酸铵交互作用的响应曲面及等高线图Fig.1 Three-dimension respose surface plot for mutual interaction between glucose and ammonium sulfate

由图1可知，当葡萄糖和硫酸铵质量分数均为1%时，RSA最低。硫酸铵质量分数为1%时，随葡萄糖质量分数增大，RSA也逐渐上升；硫酸铵质量分数为1.5%时，随葡萄糖质量分数增大，RSA提高显著。当硫酸铵质量分数再增高时，RSA随葡萄糖质量分数增大是先提高后下降趋势。当葡萄糖质量分数一定时，随着硫酸铵质量分数增大，RAS是先增大后减小。说明该氮源对RSA的变化范围适当。

图2 葡萄糖和麦麸交互作用的响应曲面及等高线图Fig.2 Three-dimension respose surface plot for mutual interaction between ammonium sulfate and wheat bran

由图2 可知，RSA随着葡萄糖和麦麸质量分数的提高而提高。其原因可能是因为葡萄糖为较好的碳源，一方面促进了酱油曲霉的生长，间接地提高了生物作用的效果。麦麸富含营养物质，在促进生物生长的同时，还提高了芝麻饼粕的通气状况。

图3 硫酸铵和麦麸交互作用的响应曲面及等高线图Fig.3 Three-dimension respose surface plot for mutual influence between ammonium sulfate and wheat bran

由图3可知，硫酸铵和麦麸交互作用可知，麦麸含量一定时，随着硫酸铵质量分数的提高，RSA是先上升后下降，并且高于1.5%时，变化更趋于明显。当硫酸铵质量分数为1.5%～1.75%时，RSA随麦麸质量分数提高变化较明显，在2.5%左右达到最大值，总趋势为随着麦麸质量分数的提高，RSA为先增加后降低，此点说明了麦麸对RSA的影响并不重要，由此也排除了发酵麦麸提高RSA占主导作用的可能。

2.4 模型验证

表7 模型验证Table 7 Verification of the model

为验证酱油曲霉固体发酵提高抗氧化能力模型方程的合适性和有效性，在葡萄糖、硫酸铵和麦麸试验水平范围内，选择性地进行了5组不同组合的实际验证实验(表7)，同时以未发酵的芝麻饼粕做对照。利用 SPSS (version14.0)软件对表7中数据进行距离相关分析得知，自由基清除活性实测值与预测值的相关系数为0.865，证明此模型是合适有效的，并具有一定的实践指导意义。选择1号验证实验的因素组合作为优化的结果，即葡萄糖1.87%、硫酸铵1.54%、麦麸2.55%，该条件下，芝麻饼粕发酵提取物实际DPPH自由基清除活性为80.26%，明显优于未发酵的对照组。

3 结 论

3.1 用Box-Behnken试验优化酱油曲霉固体发酵芝麻饼粕提高抗氧化能力的二次多项数学模型方程为：RSA/%=78.31＋2.22X1＋0.84X2＋2.27X3－0.39X1X2＋0.48X1X3＋0.32X2X3－1.77X12－2.76X22－2.06X32，且该方程的预测值与实际值相关系为0.865，符合程度高，具有一定的指导意义。根据方程优化的参数，获得较优的发酵条件为：葡萄糖、硫酸铵和麦麸质量分数分别为：1.87%、1.54%和2.55%，在该条件下发酵，DPPH自由基清除率为80.26%，未发酵的对照为42.78%。

3.2 通过对响应面试验结果的等高线图和曲面图分析，认为添加的麦麸主要是提高了通气效果，排除了抗氧化活性提高受其较大影响的可能。单独发酵麦麸，是否

具有效提高抗氧化的作用，还有待进一步探索。

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Optimization of Nutritional Supplements for Fermentation Medium based on Sesame Cake for the Production of Antioxidant Substances by Aspergillus sojae

SHAO Yuan-long，DONG Ying*
(School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

Response surface methodology was used to optimize fermentation condition to improve antioxidant activity in solidstate sesame cake by Aspergillus sojae. The effects of maltose, glucose, sucrose, fructose, wheat bran, corn steep, yeast extract and ammonium sulfate on scavenging capability of sesame cake to DPPH free radicals were evaluated by using Plackett-Burman design. Results showed that wheat bran and glucose as well as ammonium sulfate were the major factors and had significant effect on antioxidant activity. Meanwhile, the central composite experimental design and response surface analysis were used to optimize the levels of major factors. The optimal condition was 1.87% glucose, 1.54% ammonium sulfate and 2.55% wheat bran, respectively. Under this optimal fermentation condition, the scavenging capability of sesame cake to DPPH free radicals was 80.26%.

sesame cake；fermentation；optimization；antioxidant activity；Aspergillus sojae

TQ92

A

1002-6630(2010)09-0192-05

2009-01-09

江苏省科技攻关项目(BE2005335)

邵元龙(1977— )，男，博士，主要从事生物资源的深度开发与利用研究。E-mail：long9702@126.com

*通信作者：董英(1954 —)，女，教授，本科，主要从事食品功能因子和食品生物技术研究。E-mail：ydong@ujs.edu.cn