鲍鱼壳水溶性基质抗氧化活性研究

梁红宝，郭 葳，董声雄，伍久林，彭臻菲，刘志彬，张其清,2,*

(1.福州大学生物和医药技术研究院，福建 福州 350002；2.中国医学科学院生物医学工程研究所，天津 300192)

鲍鱼壳水溶性基质抗氧化活性研究

梁红宝1，郭 葳1，董声雄1，伍久林1，彭臻菲1，刘志彬1，张其清1,2,*

(1.福州大学生物和医药技术研究院，福建 福州 350002；2.中国医学科学院生物医学工程研究所，天津 300192)

考察鲍鱼壳水溶性基质(WSMA)抗氧化活性。利用DEAE-Sephadex A-25离子交换层析法(IEC)对WSMA进行纯化。以珍珠水溶性基质(WSMP)及VC为对照，通过对二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)、羟自由基(·OH)、超氧阴离子自由基(O2·)的清除能力和Fe3+还原能力的研究考察其抗氧化作用。结果表明，WSMA与WSMP具有相似的Fe3+还原能力和O2·清除能力，而对DPPH·和·OH无清除作用。通过IEC纯化得到的AⅡ组分为主要活性成分，当质量浓度为1.0mg/mL时，对O2·清除率达80%，与0.1mg/mL的VC相当。

鲍鱼壳；水溶性基质；抗氧化性；离子交换层析

鲍鱼(abalone)属于软体动物，双壳纲，其壳由角质层、棱柱层、珍珠层组成，由95%的CaCO3和0.3%～5%的有机基质构成，有机基质主要存在于珍珠层。其水溶性有机基质含量约为0.03%～0.5%，由糖蛋白、磷蛋白、蛋白聚糖和黏多糖及一些简单蛋白质组成的异相混合物约占60%以上[1]。

在人体细胞代谢过程中，由于有氧的参与而产生一些活性氧(ROS)，主要包括自由基，如超氧阴离子自由基(O2·)、羟自由基(·OH)；一些非自由基，如H2O2、1O2[2]。ROS能够引起细胞膜磷脂成分的过氧化反应，导致H2O2的积聚，而H2O2很不稳定，容易产生·OH和1O2；ROS也能破坏一些非常重要的生物大分子，如：核酸、蛋白和多糖等，如果不能及时清除ROS，则会导致细胞的老化、死亡[3]。近年来，一些人工合成抗氧化剂已经应用到食品中辅助清除人体过量自由基，但是，由于合成抗氧化剂长期使用的安全性已经受到质疑，人们迫切需要天然无毒抗氧化剂的出现。

据文献[4]报道，珍珠水提取液能显著提高小鼠体内SOD活性和降低过氧化产物(MDA)的水平，有良好的镇静、养阴和抗氧化作用；珍珠层粉水解液能较好地清除超氧自由基[5-6]。近年来，由于珍珠价格的不断攀升，而贝壳珍珠层与珍珠具有非常相似的成分，因此人们把目标投向了用废弃的贝壳开发珍珠层粉。但是，由于珍珠层位于贝壳的最内层，而且很薄，利用物理或化学方法提取，不仅费时费力，而且很容易破坏所含的有机基质生物活性。因此，为了充分利用贝壳资源，本实验直接从贝壳粉中提取水溶性基质，并通过对二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)、·OH、O2·3种自由基

的清除作用和Fe3+的还原能力来考察鲍鱼壳水溶性基质的抗氧化活性，以寻找天然的高效抗氧化剂。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai) 福建谊来鲍鱼制品有限公司；珍珠(pearl) 广西北海市铁山港区海瑞珍珠制品厂。

二苯代苦味肼基自由基(DPPH·) Alfa Aesar公司；黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶 Roche公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV 1600紫外-可见光分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；TGL-16C台式离心机 上海安亭科学仪器厂；RE-5210浓缩仪 上海亚荣生化仪器厂；SF-130C粉碎机 中国吉首市中城制药机械厂；电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；离子交换层析装置、RP-HPLC 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

将鲍鱼壳冲洗干净自然晾干后，用粉碎机粉碎成80～120目的粉末。称取100g粉末放入200mL蒸馏水中，4℃搅拌溶解24h，取出混合液，残渣再用水提取两次后合并到混合液里，过滤后，4℃条件下以12000r/min离心20min，上清液即为鲍鱼壳水溶性基质(WSMA)。

同法制备珍珠水溶性基质(WSMP)。

1.3.2 DPPH·体系中抗氧化活性测定

[7]的方法：试管中依次加入：0.2mL样品溶液，1.8mL蒸馏水，2.0mL 2.0×10-4mol/L DPPH溶液，混合均匀后在室温下避光反应30min。在517nm波长处测定吸光度；空白为以等体积无水乙醇代替DPPH·溶液；对照为以等体积蒸馏水代替样品溶液。DPPH·清除率依据公式(1)计算。

式中：Ax为加入样品后溶液的吸光度；Ax0为样品溶液本身的吸光度；A0为未加样品溶液的吸光度。

1.3.3 ·OH体系中抗氧化活性测定

参考文献[8]的方法：在试管中依次加入1.0mL 9.0mmol/L FeSO4，1.0mL 9.0mmol/L水杨酸-乙醇溶液，0.2mL样品溶液，1.0mL 8.8mmol/L H2O2，每加入1种试剂都要充分混匀，置于37℃水浴中保温45min，冷却至室温，于波长510nm处测吸光度。·OH清除率按照式(1)方法计算。

1.3.4 O2·体系中抗氧化活性测定

参考文献[9]的方法：在试管中依次加入1.0mL 75mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.8)，待测样品0.2mL，0.1mol/L盐酸羟胺溶液0.1mL，75mmol/L黄嘌呤氢氧化钠溶液0.1mL，0.1U/mL黄嘌呤氧化酶0.1mL，摇匀后置于37℃水浴30min，加入2.0mL显色剂，静置10min后于530nm处测定吸光度。O2·清除率根据式(2)计算。

式中：Ai为加入抗氧化剂后的吸光度；A0为未加入抗氧化剂时的吸光度。

1.3.5 Fe3+还原能力测定

采用FRAP的方法测定Fe3+还原能力[7]：将200μL样品液同1.0 mL三价铁还原抗氧化能力测试工作液(FRAP) (0.2mol/L，pH3.6乙酸钠缓冲液、10mmol/L TPTZ和20mmol/L 三氯化铁以体积比10∶1∶1混合)混合，37℃反应10min，在593nm处测定吸光度。绘制样品- FeSO4质量浓度的标准曲线，以直线斜率表示还原能力的相对大小。

1.3.6 离子交换层析(IEC)分离

取100mL经过1kD透析袋透析后的WSMA上样于DEAE-Sephadex A-25离子交换层析柱。洗脱条件为：0～0.6mol/L NaCl 20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液120mL线性梯度洗脱，接着用2.0mol/L NaCl溶液洗脱，流速为1.0 mL/mi n，紫外检测2 8 0 n m波长处的光密度(OD280nm)，自动收集器每管3mL收集洗脱液，并冷冻干燥，贮存备用。

1.3.7 活性组分主要成分分析

利用Bradford法[10]进行蛋白含量测定，以牛血清白蛋白为标准物，所得标准曲线为：Y=10.63X+0.0252，R2= 0.9907。利用苯酚-硫酸法[11]进行多糖含量测定，以葡萄糖为标准物，所得标准曲线为：Y=17.206X+0.0154，R2＝0.9934。

2 结果与分析

2.1 WSMA自由基清除率测定结果

由图1可见，质量浓度为0.1、1.0、10mg/mL的WSMA对DPPH·和·OH的清除率都在5%以下，甚至出现负值，说明WSMA中可能存在一些具有氧化性的物质，而起到相反的作用。WSMA对O2·的清除率则从9.29%提高到50.02%。由此可见，WSMA的抗氧化性较强，且主要表现为清除O2·活性。当质量浓度为1.0mg/mL时，WSMA对O2·的清除率约为30%。

图1 不同质量浓度的WSMA对DPPH·、·OH和O2·的清除作用Fig.1 Scavenging capabilities of WSMA at various concentrations to DPPH·,·OH an d O2·

2.2 WSMA的IEC层析及对O2·清除能力测定

图2 WSMA在不同NaCl浓度下的洗脱曲线Fig.2 Elution profiles of WSMA at different salt concentrations

由图2可见，通过对WSMA进行离子交换分离，先用浓度为0～0.6mol/L NaCl溶液进行线性洗脱，可以得到一个比较宽的钟形峰，命名为AⅠ；再用2.0mol/L NaCl溶液洗脱，洗至无紫外吸收时，收集得到一个比较强的尖峰，命名为AⅡ。分别收集合并AⅠ、AⅡ峰尖部分洗脱液，进行O2·清除率测定。

图3 AⅠ与AⅡ组分对O2·的清除作用Fig.3 Scavenging effects of AⅠ and AⅡ on O2·

由图3可知，组分AⅠ基本没有抗氧化活性，组分AⅡ具有较好的活性，对O2·清除率达到60%左右，因此，经过纯化的AⅡ为WSMA的主要抗氧化作用组分。2.3WSMP、WSMA和AⅡ对Fe3+的还原能力测定结果

由图4可知，FeSO4质量浓度在0～0.5mg/mL时，线性关系良好，回归方程Y＝2.1237X＋0.0072，R2＝0.9999。在0～1.0mg/mL范围内，不同质量浓度样品对应FeSO4的质量浓度线性关系良好。WSMP、WSMA、AⅡ相应的回归直线的斜率分别为：0.037、0.047、0.11，可见AⅡ具有最强的还原能力，而WSMP 和WSMA则相对较弱。

图4 WSMA、AⅡ、WSMP对Fe3+的还原能力Fig.4 Reducing power of WSMA, AⅡ and WSMP to Fe3+

2.4 WSMP、WSMA和AⅡ对O2·清除能力的测定

图5 WSMA、WSMP、AⅡ与VC对O2·的清除率Fig.5 Scavenging effects of WSMA, WSMP, AⅡ and vitamin C on O2·

由图5可以看出，在0.01～1.0mg/mL质量浓度范围内，WSMP、WSMA对O2·具有相似的清除效果，尤其在质量浓度小于0.5mg/mL时，二者的清除率-质量浓度曲线基本重合。而组分AⅡ与WSMA、WSMP相比，清除率提高了1～1.5倍。质量浓度为1.0mg/mL的WSMP、WSMA对O2·清除率分别为39%和30%，而AⅡ则高达80%，与0.1mg/mL的VC清除能力相当。

此外，在0～1.0mg/mL范围内，WSMA、WSMP与AⅡ对O2·的清除率随着样品质量浓度的增大而增大，基本呈线性变化，表明三者的作用方式可能相同，而VC的作用曲线在0～0.1mg/mL范围内线性增大，此后速率不再随样品质量浓度变化而改变，与它们模式不尽相同，因而它们作用方式可能存在区别。O2·清除作用的机理一般有3种：1)抗氧化剂可以结合O2·形成一种更稳定的自由基而终止反应；2)抗氧化剂可能直接淬灭O2·；3)抗氧化剂可能干扰黄嘌呤氧化酶的活性，从而根本上消除了自由基的产生。对WSMA、WSMP与AⅡ对O2·的清除机理还需要进一步研究。

2.5WSMA和AⅡ蛋白和多糖含量的测定

表1 WSMA和AⅡ的蛋白和多糖含量的测定结果Table 1 Determination of proteins and polysaccharides in WSMA and AⅡ

由表1可知，WSMA中蛋白和多糖含量较低，而经过纯化后得到的AⅡ蛋白质量分数提高约10倍，达到3.5%，多糖含量也由1.3%提高到9.0%。由WSMA和AⅡ的外观来看，二者很可能都含有一些色素类物质，并且AⅡ中含量更高。与WSMA相比，AⅡ的蛋白、多糖、色素含量都明显增加，而抗氧化活性也随之增大，因此，可以推断它们可能对抗氧化活性都具有一定贡献。

由于鲍鱼壳成分复杂，仅仅通过透析和离子交换层析很难制得纯组分，许多研究[12-14]也证明了这一点。对AⅡ的进一步的分离纯化还有待下一步研究。

3 结 论

WSMA与WSMP相似，具有较好的Fe3+还原能力和O2·清除能力，而对DPPH·和·OH无清除作用。WSMA通过IEC纯化得到AII组分为主要活性成分，当质量浓度为1.0mg/mL时，对O2·清除率达80%，与0.1mg/mL的VC相当。AⅡ组分成分复杂，含有蛋白、多糖、色素等物质，都可能具有抗氧化活性，对它的进一步分离纯化工作还在进行。

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Antioxidant Activity of Water-soluble Matrix from Abalone Shell

LIANG Hong-bao1，GUO Wei1，DONG Sheng-xiong1，WU Jiu-lin1，PENG Zhen-fei1，LIU Zhi-bin1，ZHANG Qi-qing1,2,*
(1. Institute of Biomedical and Pharmaceutical Technology, Fuzhou University, Fuzhou 350002, China；2. Institute of Biomedical Engineering, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300192, China)

The water-soluble matrix from abalone shell (WSMA) was purified by ion exchange chromatography (IEC) in DEAESephadex A-25 column. The antioxidant activity of WSMA was evaluated by scavenging capabilities of DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazy), hydroxyl (·OH) and superoxide anion (O2·) free radicals, and reducing powder of ferric ions. Compared with water-soluble matrix from pearl (WSMP) and vitamin C, WSMA revealed the similar reducing power and scavenging capability to O2· with WSMP, however, both WSMA and WSMP exhibited a weak inhibition effect on DPPH· and ·OH. The fraction from the second peak (AⅡ) separated by IEC was the major bioactive component. The scavenging capability of 1.0 mg/mL AⅡ to superoxide anion free radicals was 80%, which was equivalent to 0.1 mg/mL vitamin C.

abalone shell；water-soluble matrix；antioxidant activity；ion exchange chromatography

TS254.4

A

1002-6630(2010)09-0113-04

2009-09-07

梁红宝(1985—)，男，硕士研究生，主要从事功能高分子研究。E-mail：ruby-boy@tom.com

*通信作者：张其清(1954—)，男，教授，博士，主要从事生物医学工程研究。E-mail：zhangqiq@126.com