微生物富集方法及其应用的研究进展

张敬敬，刘晓颖，钱开诚

1. 华东师范大学、上海市血液中心研究生培养基地，上海 200051； 2. 上海市血液中心，上海 200051

微生物富集方法主要包括物理法和生物亲和法2大类。常用物理方法包括过滤法(filtration method)、离心法(centrifugation method)等(表1)。生物亲和法是根据微生物特性将其与固相载体结合以实现分离，它可分为特异性结合与非特异性结合2种，磁性分离法是生物亲和分离法的一种。本文阐述过滤法、密度梯度离心法及磁性分离法3种富集微生物的方法及其应用，重点介绍磁性分离法及其在病原微生物富集及检测方面的应用。

1 分离、富集细菌的物理方法及其应用

1.1 过滤法

过滤法富集微生物是将适当孔径的滤膜放入滤器，过滤样品。由于滤膜的作用而将微生物滞留在膜表面，使微生物与样品溶液分开，达到微生物富集目的。临床上常用富集微生物的滤膜孔径为0.22 μm和0.45 μm，前者通常用于医用注射液及化学溶液除菌，后者常用于富集体液如脑脊髓液[1]、痰液[2]中的微生物。Sankaran等[3]利用膜过滤法过滤分离人粪便中的志贺菌属和大肠埃希菌，可有效去除后续细菌检测的干扰因素。过滤法的优点在于成本低、速度相对较快且微生物浓缩效果明显，适用于大体积样本中微生物的富集。临床上过滤法主要用于体液等样品中的微生物富集，但较少用于有一定黏稠度的样品，如全血或血小板等标本。原因在于一方面血液制品中含有与微生物大小相仿的其他细胞，无法完全将微生物与样品完全分离；另一方面血液制品的黏稠度较大，易堵塞滤孔。

表1常用细菌富集方法的比较

Tab.1Comparisonofmethodsformicrobialenrichment

为进一步提高过滤法富集细菌的效率，Zierdt等[4]利用带正电的滤膜通过静电吸附作用使革兰阳性菌从样品中分离，原理在于革兰阳性菌的细胞壁含有磷壁酸，带有负电荷。细菌荷电性的大小与所在样品的电解质、pH值、细菌种类及生长阶段有关，通过对这些参数的优化可进一步提高细菌的分离、富集效率。另外，交错流过滤技术为解决滤孔堵塞问题提供了帮助。原理如下：在泵的推动下样品平行于膜面流动，与垂直过滤不同的是样品流经膜面时产生的剪切力把膜面上滞留的颗粒带走，从而减少滤膜堵塞。此外，还有滤器生产商为减少堵塞、加速过滤而采用紧贴于滤膜的“搅拌”装置。

1.2 离心法

离心法是借助于离心力，对比重不同的物质进行分离的方法。在临床基础研究中，常用直接离心法和密度梯度离心法来分离样品中的微生物。直接离心法是在不加入介质的条件下，直接对样品中的细菌进行离心分离，使大部分细菌沉降于管底，达到将细菌分离、富集的目的。然而，直接离心的同时样品中与靶细菌密度相近的其他成分也会随之沉淀，影响分离后细菌的纯度。

密度梯度离心法(density gradient centrifugation method)是用一定的介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度，将细菌混悬液置于介质的顶部(底部或混匀)，根据细菌在密度梯度液中的比重不同，通过离心力的作用使靶细菌分离。密度梯度离心法通常分为速率沉降和等密度沉降2种。速率沉降适用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器，等密度沉降适用于分离密度不等的颗粒。密度梯度离心常用的沉降介质有蔗糖、氯化铯、Ficoll液、Percoll液等，其中Ficoll液、Percoll液常用于细胞分离。Ficoll液为聚蔗糖，Ficoll-Paque PLUS(Ficoll-泛影酸钠)是无菌、即用型的，有合适的密度、黏度和渗透压，能够简单、快速地从人外周血、骨髓和脐带血中分离淋巴细胞及单个核细胞。Percoll液是一种表面包被聚乙酰胺吡咯烷酮的硅胶颗粒，无毒、无刺激性，对细胞无吸附作用，产生的渗透压很小，可在全部密度范围保持等张。

Ficoll液、Percoll液也可用于微生物细胞的分离、富集。Zierdt等[4]将Ficoll密度梯度离心法与膜过滤法结合，用于人全血中的大肠埃希菌、肺炎克雷白菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、铜绿假单胞菌、唾液链球菌、肺炎链球菌等12种细菌的富集、分离。与传统的血培养方法相比，密度梯度离心法的富集效率明显提高。另有研究应用Ficoll等密度梯度离心法成功富集培养基中的枯草芽胞杆菌。Lindqvist等[5]利用Percoll密度梯度离心法富集食物匀浆中的大肠埃希菌O157∶H7，通过细菌的富集，减少后续聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测细菌时的干扰因子。Arakaki等[7]将该法用于宿主细胞中鲑鱼立克次体的富集，在所选用的不同浓度Percoll液中，发现30%的Percoll液最适于立克次体的富集。此外，该法还可用于红细胞内伯氏疟原虫的分离等。密度梯度离心法富集微生物的缺点在于成本昂贵，可处理的样品种类、体积有限，且难以实现不同种类微生物的分离，因而造成大量微生物丢失。由于分离介质等干扰因素的存在，需对富集后的微生物进行洗涤处理，整个实验过程较为繁琐。

2 分离、富集细菌的生物亲和方法及其应用

生物亲和法是指利用2种物质的高亲和性，如通过抗体和抗原特异识别或基团共价结合等，纯化和分离靶物质。磁性分离技术是生物亲和分离法的一种，分为非特异性与特异性(免疫)磁性分离(immunomagnetic separation, IMS)2类。

2.1 细菌的非特异性磁性分离

未经包被单克隆抗体的超顺磁性Fe3O4粒子为裸磁珠。有研究表明[6]，裸磁珠可非特异性吸附细菌，对大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌等常见病原菌的富集率高达98%。对裸磁珠非特异性吸附细菌的吸附率、实验条件及参数进行优化(如磁珠规格、保存方法、用量、孵育时间及温度等)，将为裸磁珠在细菌富集领域的应用奠定基础。

除裸磁珠外，可用于细菌富集的材料还有生物纳米磁珠(bacterial magnetic particle, BacMP)、蒙脱石(montmorillonite, MMT)等。生物纳米磁珠是在磁性细菌(magnetic bacteria)菌体内形成，直径50～100 nm。磁珠中心主要成分为超顺磁性Fe3O4颗粒，外层包被约14 nm有机生物膜，与人工合成磁珠的包被层相比，其厚度均匀，与中心磁珠结合紧密，不易脱落，易于进行化学修饰及抗体包被，且在溶液中的分散度好，便于提取，成本低廉[7]。生物纳米磁珠已被用于多种细菌的富集和检测[8]及细菌DNA抽提[9]。蒙脱石是一种硅酸盐矿物，含有2层硅氧四面体中间夹有铝氧八面体的“车厢式”结构，各层间产生强弱不同的永久性负电荷，该“车厢式”结构能将细菌固定到“车厢”中。研究发现，纳米蒙脱石颗粒对多种细菌如大肠埃希菌、霍乱弧菌、空肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌均有较好的吸附作用。但蒙脱石只吸附表面带有粒编码蛋白(CS31A)的病原菌，对表面不带CS31A的正常菌群无吸附作用。蒙脱石一般用于治疗腹泻，对其在微生物富集和检测方面的报道尚为少见[10]。

2.2 细菌的免疫磁性分离

免疫磁性分离技术是利用包被有单克隆抗体的纳米磁珠，与含有相应抗原的靶物质结合，通过磁场作用将结合有靶物质的磁珠富集，从而达到纯化、富集目的。免疫磁珠由超顺磁性Fe3O4颗粒构成核心，其外包被氧化硅或多聚物如聚苯乙烯、聚氯乙烯等，外层也可连接各种基团。不同磁珠包被材料有不同用途，根据氧化硅可特异性吸附核酸的特性。通常将包被氧化硅的免疫磁珠用于核酸的富集和分离；而包被聚苯乙烯的免疫磁珠可结合羧基、氨基等，多用于蛋白的分离和纯化；也可根据实验需要将特异性单克隆抗体包被于裸磁珠上而发挥不同用途。此外，磁珠颗粒的直径、表面基团等也对富集效率有影响。磁珠的直径及其均匀度影响其在溶液中的分散度、磁响应度、聚集力等，各种直径规格及用途的磁珠均在不断研发中，典型的磁珠直径有1.0 μm、2.8 μm、4.5 μm等。1.0 μm常用于体外诊断和高通量分析，2.8 μm磁珠多用于富集蛋白质、多肽、抗体、酶、激素、受体等，4.5 μm磁珠常用于富集细胞或细胞器等。磁珠的表面基团种类繁多(如羧基、氨基、甲苯磺酰基、环氧基、醛基、羟基、羰基等)，可与抗体、受体、寡核苷酸链等结合，形成磁性生物材料，用于靶向目标分子的富集。免疫磁性分离技术可用于分离核酸、蛋白质、病原体及各种细胞等，具有高特异性、高浓缩性、高分离率，且可从大量细胞中筛选出带有特异性标记的极少量细胞而不影响细胞活性。免疫磁性分离技术因简便、易行、分离纯度高、能保留靶物质活性等优点而被广泛应用于基础及临床研究中。磁性分离技术亦是近年来应用于细菌学诊断的有效方法之一，可将分散在样品中的少量细菌富集，从而显著提高细菌的检测效率，且富集过程仅需10 min～1 h。但磁性分离技术应用于细菌的特异性分离受到包被抗体种类、抗体价格及分离细菌种类等方面的限制。

2.3 磁性分离技术在病原微生物检测中的应用

目前常用的病原微生物检测有应用显微镜等技术的物理、化学方法，以及针对病原微生物抗原或抗体的免疫学方法。这些检测方法可处理的样品体积有限，因此有效的病原微生物富集方法显得尤为重要。随着研究的日益深入，免疫磁性分离技术与酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、PCR、荧光定量PCR、流式细胞技术、免疫荧光显微技术等相结合，已被广泛用于临床病原微生物的检测[11]。

2.3.1富集后用于病原微生物的细胞检测检测病原微生物细胞主要根据微生物物理、化学特性或特异性蛋白直接采用流式细胞技术、免疫荧光技术等进行检测。Hibi等[12]将磁性分离技术与流式细胞技术结合，用于水中黄杆菌冷菌(10～108CFU/ml)快速检测与计数。以直径1 μm的兔抗黄杆菌冷菌IgG抗体包被的羰原微生物核酸的分子生物学方法，基磁珠作为黄杆菌冷菌磁性富集的固相载体，在抗体上标记异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)对富集后的细菌用流式细胞仪进行检测与计数，发现流式细胞计数与磁性分离技术结合后，可将黄杆菌冷菌检测的灵敏度从106CFU/ml提高至10 CFU/ml，整个细菌检测过程可在2 h内完成。还有学者将磁性分离技术与侧向流动技术(lateral flow method)结合，用于检测水中和奶制品中的炭疽杆菌芽胞[13]。此外，磁性分离技术还被广泛用于各种免疫分析，如荧光免疫分析、酶化学发光免疫分析等[14]。磁珠结合一抗或二抗后，可用于微生物的分离与定量，可省去离心步骤，节约时间，简化操作，且显著提高检测效率与准确性。有学者采用荧光免疫分析法，将FITC与抗大肠埃希菌单克隆抗体结合，并固定于生物纳米磁珠上，用于检测和去除大肠埃希菌。免疫磁性分离技术已被用于富集与检测多种病原微生物，如人粪便中的幽门螺杆菌、尿液中血吸虫循环抗原以及水体中的贾第虫孢囊和隐孢子虫卵囊等[15]。

2.3.2富集后用于病原微生物的核酸检测利用免疫磁性分离技术捕获样品中的靶病原菌，可显著提高病原菌核酸检测效率。有研究将免疫磁性分离与PCR结合，用于人血清和尿液中细螺旋体的检测。他们用包被抗LipL32单克隆抗体的蛋白A磁珠，首先对人血清和尿液中细螺旋体进行富集，再用PCR检测富集后的细螺旋体，检测效率高达162 CFU/ml。

2.3.3富集后用于病原特异性蛋白的检测有学者[16]将免疫磁性分离技术与激光解离质谱技术结合，检测金黄色葡萄球菌肠毒素蛋白B。此外，有关病原菌磁性分离的试剂盒产品已有许多，如大肠埃希菌、沙门菌、李斯特菌、军团菌磁性分离试剂盒。基本原理是通过磁珠表面的高亲和力抗体与病原菌表面标记物结合来分离靶细菌，整个分离、富集过程仅需1 h，检测效率及自动化程度均明显提高。

3 微生物富集的其他方法

除以上常用微生物富集方法外，最近有学者[17]将微流体技术与荧光激活细胞分选技术用于人全血(红细胞浓度约108/ml)中大肠埃希菌的富集，可将全血中的大肠埃希菌浓缩300倍。微流体技术是指在微观尺寸下控制、操作和检测复杂流体的技术，可将流体样品的制备、生化反应、结果检测等步骤集成到生物芯片上(如样品DNA制备、PCR反应、电泳检测)，使实验所用流体的量从毫升、微升级降至纳升或皮升级。此外，还有学者根据细菌的特性，采用凝胶吸附方法富集靶细菌。Kuyukina等[18]根据红球菌具有与烷烃高亲和的特性，应用多聚丙烯酰胺冻凝胶，在含多种细菌的培养基中特异性地吸附红球菌，富集效率达72%。原理是细菌通过表面蛋白与凝胶中的配基发生特异性结合而被吸附到凝胶上，从而达到细菌的富集和分离。

4 结语

微生物富集作为提高微生物检测效率的有效途径，在生物医学及临床等领域一直备受关注。常用的微生物富集方法有过滤法、离心法、磁性分离法等。过滤法和离心法是根据微生物的物理特性，非特异性地富集微生物，适用的菌种较广泛，但在实际应用方面存在一定不足。如过滤法容易出现堵塞滤孔，无法用于黏稠样品中的微生物富集及特异性分离靶微生物等。密度梯度离心存在成本高、操作繁琐、灵敏度低等不足，仍需进一步改进，提高特异度及灵敏度，简化操作。磁性分离技术已被广泛应用于免疫学、分子生物学、生物动力学、基因工程等各领域，包括高通量的核酸、蛋白质、细胞及细胞器、微生物的分离，免疫分析，病原体检测，生物大分子之间相互作用的研究等。随着激光质谱、微阵杂交[19]等高新检测技术的不断发展，磁性分离技术与之结合将有更大的应用空间。总之，因磁性分离技术具有快速、低成本、可自动化调节、高特异度等优点，故在分离技术的自动化与微型化方面有广阔的应用前景。

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