发现新病原、建立新病原学的技术与理论体系

徐建国

中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室，北京 102206

当不明原因性传染病突发疫情在某个国家或地区出现时，如能在第1时间发现和明确病原体，就可为控制疫情赢得时间。对新病原体的检测、分离、鉴定，是一个国家传染病应急防控能力和水平的标志性体现[1]。

我国对不明原因性传染病突发疫情的应急处理，主要由各级疾病预防控制机构(过去称防疫站)承担。 这些机构曾经出色完成了对霍乱、苏皖大肠埃希菌O157∶H7、四川人感染猪链球菌暴发等多起突发重大疫情的处理，积累了应对不明原因性传染病突发疫情的经验，造就了一批有实际经验的人才，为经济发展和社会稳定作出了贡献[2,3]。但是，仍有一些规模小的不明原因性传染病突发疫情未获得病原学证据[4]。

近年来，不明原因性传染病突发疫情在我国不断出现，现实生活中也有生物袭击或威胁的发生(如2009年新疆针扎事件)。为应对不明原因性传染病突发疫情，迫切需要建立发现新病原的技术体系及有关新病原学的理论，以指导发现新病原的工作。最近几年，国内、外已发表了不少探讨和发现新病原的论文，国外有的大学成立了发现新病原的实验室，我国国家疾病预防控制中心传染病预防控制所于2009年也成立了新病原室，应对这一挑战。

如何定义新病原体是一个值得商榷的问题。从应对不明原因性传染病突发疫情和公共卫生的角度来看，新病原体应包括3类：①在某个国家或地区第1次出现的病原体；②已发生变异、毒力增强、引起疾病流行和患者死亡、使用现有技术和方法无法给予准确诊断或鉴定的病原体；③在世界范围内第1次出现的病原体。近年来，大多数不明原因性传染病疫情基本上都是由上述3类病原体引起的。

为及时、准确地发现和鉴定这些新的病原体，应从以下几方面着手。

1 建立病原体检测技术储备，应对我国第1次出现的病原体

美国等一些发达国家对病原体的研究范围几乎覆盖了所有的病原体。即使目前在这些国家没有病例报告的病原体，他们也投入大量资金，开展研究工作，包括致病机制、检测、诊断、疫苗、药物等。正是由于拥有这种雄厚的知识和技术储备，他们才能够在新发传染病发生时，迅速明确诊断，及时采取措施，控制疫情发展。严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)就是一个典型的例子[5,6]。

相比之下，我国研究病原体的种类及范围均很小。即使是对一些我国法定传染病的病原体，目前也尚无稳定的研究队伍；对许多在世界学术界已引起非常关注的病原体，尚未开展研究工作；对一些曾在我国引起重大疫情、目前病例不多的病原体，研究队伍正在缩小或消失[7]。

针对可能在我国第1次出现的病原体，最好的策略就是建立病原体检测和诊断技术储备。1999年我国处理苏皖大肠埃希菌O157∶H7暴发的经验显示，建立技术储备是应对在一个国家或地区第1次出现的病原体的有效手段[3]。如果没有技术储备，一旦发生疫情，要在很短时间内对一个过去并不熟悉的病原体准确作出相关病原学诊断，对病原学专家来说是一项非常严峻的挑战[8]。

1999年4～8月，我国江苏省和安徽省突然有194例患者从腹泻等先驱症状发展为少尿、无尿而入院，其中174例因突发肾脏和(或)其他脏器衰竭而死亡。当时曾一度怀疑由出血热、钩端螺旋体病、假药中毒等引起。由于病因不明，疫情控制没有方向，政府难以决策，谣言四起，以致当地群众的生命安全和社会稳定受到严重威胁。我们受卫生部派遣，和地方疾病预防控制中心一起处理疫情。 由于本实验室从1986年就开始研究大肠埃希菌O157∶H7，建立了针对溶血素和志贺毒素基因的DNA诊断探针、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)、针对溶血素和O157脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的转膜杂交等方法。我们使用这些已建立的技术和方法，与当地疾病预防控制中心的同仁一起，迅速从临床标本分离到病原体，在患者血清中检测到特异性抗体，从患者家庭饲养的猪、牛、羊、鸡等动物分离到病原菌，提出将疫情确定为大肠埃希菌O157∶H7感染的建议。卫生部接受了这一诊断建议，迅速采取措施，有效控制了迄今为止世界范围内流行规模最大、死亡人数最多、持续时间最长、发病情况最复杂的一起大肠埃希菌O157∶H7暴发[3,9]。

从2004年开始，我国对传染病的预防、控制工作有了稳定的资金投入。我们根据国内、外研究结果的流行病学资料，广泛征集专家意见和建议，扩大传染病病原体的研究范围，慎重布局，逐步实施；每年组织科研力量，对十余种新的、罕见的、我国尚未开展研究工作的病原菌进行研究，着重提高检测、鉴定、分析和诊断的能力；基本上建立了能对80种新病原性细菌作出诊断的技术阵列。这些预警的技术储备，在随后应对猪链球菌、无形体等疫情的病原学诊断发挥了作用。如本研究所自2004年已启动猪链球菌研究工作，当2005年四川省发生世界上最大的人感染猪链球菌疫情并引起国内、外广泛关注时，由于本实验室已建立了PCR等检测方法，引进了参考菌株和诊断血清，在接到尸体解剖标本数小时后，就用PCR方法检测到病原菌存在，3 d后获得病原菌并完成鉴定。从理论上说，这是从临床标本培养、分离、纯化、鉴定一个病原菌所需的最短时间。我们及时向卫生部递交了实验室诊断报告。卫生部很快公布了疫情诊断结果，指导了疫情的控制工作[10,11]。

我国发现人粒细胞无形体病(human granulocytic anaplasmosis，HGA)也证明了建立技术体系储备的价值。 2006年11月，安徽省某医院一疑似出血热的患者死亡数天后，5名陪护亲属和4名参与抢救的医护人员均被传染。在排除出血热病毒等30余种病原体后，安徽省疾病预防控制中心提出可能是埃立克体的建议，向我们提出技术支持的请求。由于我们在2006年初就开始建立埃立克体、无形体诊断技术的储备，已经合成了引物，引进了血清学诊断试剂，所以很快完成了检测工作。根据血清学和病原体基因分析数据，提出HGA的诊断意见。HGA的病原体是嗜吞噬细胞无形体，主要通过蜱传播，此前没有人-人传播的报道。通过对病原学和血清学结果的双盲验证，以及对与首发患者接触时间、接触方式和接触时间(以分钟为单位)的调查、对比和分析，提出了安徽省HGA人-人传播的结论，得到国内、外同行认可。论文在美国医学会杂志(JAMA)上发表，耶鲁大学Krause教授等应邀撰写的评论认为，此研究的重要意义是 “在世界上第1次发现嗜吞噬细胞无形体可以人-人传播，在中国第1次发现HGA病例”。由于该发现，卫生部颁布了《人粒细胞无形体病预防控制技术指南》，要求HGA高发地区的医务人员要强化护理和抢救过程中的保护措施，减少发病和死亡[12]。

2 建立中国病原菌分子分型网络，发现发生变异的病原体

在细菌的进化过程中，点突变、基因重组、基因水平转移和丢失等是主要的推动因素。过去认为，点突变是病原性细菌发生的主要因素，因而新的病原性细菌的产生和进化过程比较缓慢。通过研究细菌“获取”与“缺失”基因的机制发现，大片段基因的获得和缺失可使细菌基因在短期内发生量的飞跃。也就是说，可以在短时期内产生许多新的突变株，包括新的病原性细菌。噬菌体、质粒为细菌的可移动遗传元件，它们的参与加速了细菌的进化过程。如细菌可通过DNA转换、噬菌体转导、质粒介导的结合作用等水平转移方式，获得外源基因成分，从而具有一些新的特征，如对抗生素的耐药性、产生毒素的能力等。细菌还可通过缺失一部分基因，使自己能更适应环境的变化。上述多种构成细菌变异的机制，可使细菌的致病性增强，引起疾病流行[13]。

因此，我们建立了中国病原菌分子分型网络(PulseNet China)，有助于发现发生变异的病原体[14]。PulseNet是由美国疾病预防控制中心建立的食源性细菌传染病实验室监测网络，1998年5月由当时美国副总统戈尔在白宫宣布成立。该网络利用标准化的细菌实验室分子分型技术，通过分布于各地的网络实验室实际检测和监测，建立网络平台，及时交流和比对数据，从而可识别食源性传染病发生的关联，调查暴发流行，快速鉴定暴发的来源[15,16]。

PulseNet的精髓是数据的可比性和共享性。所有参与的实验室都使用相同的实验程序，保证获得的结果可相互比较。因此，能够实现美国乃至全球范围的信息共享。这一网络平台能发现看似无关的传染病事件之间的内在联系，早期发现暴发或暴发趋势，有助于控制疫情[15,16]。

我们借助PulseNet的理念，把覆盖范围扩大到所有病原性细菌，把分型技术从脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)扩展到多位点可变数目串联重复序列分析(multiple-locus variable-number tandem repeat analysis， MLVA)、多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)等，期望能够发展细菌基因组水平的分型技术。PulseNet China 是我国细菌性传染病实验室监测的未来。我们希望在PulseNet China的平台组建所有从事细菌实验室监测的同盟，使全国范围内的科技工作者，可用此平台判断不同分离株之间的关系。因为当某个菌株引起疾病暴发，自暴发中分离的不同菌株应该是相同或几乎相同的(因可能存在偶然的变异)。对不同分离菌株的分子分型，在识别暴发，确定传染来源、流行范围、传播链，发现特殊菌株等流行病学调查方面具有重要作用。通过分子生物学技术对病原体进行分子分型，是调查暴发、流行的有效分析手段。使用PulseNet China 技术，我们曾发现了几个发生变异并在我国引起重大疫情的病原菌。

2.1 脑膜炎奈瑟菌ST-4821complex(序列群)的发现和命名

在我国，流行性脑膜炎几十年来一直以A群为优势血清群。2003～2005年，安徽省突然发生C群流行性脑膜炎暴发，并迅速传到其他省份，一度疫苗告急。我们迅速组织起一支以研究生为主的队伍投入工作。使用PulseNet China 建立的PFGE和MLST技术，发现优势病原体发生了变异，并在进化树上形成一个新的亚群，将其命名为ST-4821序列群。该发现使我国预防和控制流行性脑膜炎的策略发生了重大改变，特别是对预防用抗生素的调整。研究结果于2006年在Lancet上发表[17]。

2.2 福氏志贺菌一个新血清型Fxv的发现

我国的细菌性痢疾主要由福氏志贺菌引起。几十年来一直认为，福氏志贺菌的15个血清型中，福氏2a志贺菌(Shigellaflexneri2a, F2a)的分离率最高，占80%左右，因此发展疫苗首先应考虑福氏2a。2001年在河南省发现一种新的血清型，分离率超过F2a，连续5年成为第一优势血清型。使用单价诊断血清鉴定，结果为F4c。基因组分析发现，其没有编码F4的型抗原基因gtrIV，故不能鉴定为F4；但具有编码Fx变种的抗原基因gtrX，将其命名为Fxv。使用MLST扩展分析技术发现，我国95%左右的福氏志贺菌分离株，包括Fxv、F2a等优势血清型，属于一个新的序列型，该序列型被命名为ST91。研究结果表明，在我国存在一个福氏志贺菌优势克隆群ST91，包括十余个血清型的菌株。福氏志贺菌ST91可通过噬菌体转导等方式不断变换血清型，规避人群建立的型特异性免疫保护。因此，志贺菌疫苗的发展策略必须重新设计。志贺菌痢疾是我国的常见病、多发病，在志贺菌的46 个血清型中，只有这个血清型是由我国科学家首先发现和命名的[18]。

2.3 猪链球菌序列7型的发现及在我国的流行

2005年四川省发生人感染猪链球菌的疫情，有 61例表现出不寻常的链球菌中毒性休克样症状，38例死亡，呈现发病急、死亡快的现象。血清学方法发现，病原体是血清2型猪链球菌。但由于许多血清2型猪链球菌的分离株是不致病的，因此使用MLST技术检测，发现病原体是序列7型猪链球菌，由序列1型变异而来，且毒力增强。迄今为止，序列7型猪链球菌只在我国发现，而致病性比较低的血清2型猪链球菌则属于ST25型[11]。 据此，我们根据临床表现、动物实验、基因组分析等数据，将猪链球菌分为中等致病群、高致病群和流行群。中等致病群猪链球菌以ST25型等为主，虽能引起猪感染，但少有引起人感染的报道，没有引起人感染死亡的报道，主要分布于北美；高致病群猪链球菌包括ST1型，主要分布于欧洲和亚洲，能引起猪感染，虽然有大量引起人感染和死亡的报道，但没有引起大规模的人感染暴发，引起休克较少；流行群猪链球菌有ST7 型，能在人间引起暴发和在动物中流行，引起休克和死亡。我们继而提出猪链球菌的“两阶段致病”理论：第1阶段发生在高致病群或流行群猪链球菌进入血液的数小时内，主要特点是病原体刺激机体产生超量细胞因子, 如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)等，可导致宿主约在24 h发生休克和死亡；第2阶段的主要特点是病原菌依靠毒力因子，通过血-脑屏障，引起脑膜炎。“两阶段致病”理论不仅对决定患者的预后发挥关键作用，还提示猪链球菌感染患者早期治疗的重点是预防休克发生和抗休克治疗，从而降低病死率[10]。

3 致力于发现世界范围内第1次出现的病原体

在世界范围发现第1次出现的病原体是一种挑战。测序技术的飞跃发展，给发现新的病原体提供了新的手段和思路。所有的细菌都有16S rRNA，根据16S rRNA的差异，可将细菌鉴定为科、属、种。16S rRNA 序列分析比较是鉴定细菌的金标准，但该技术有一定的限制，对数据的质量要求很高，PCR合成过程可能会产生一些差异。但是，从临床标本中发现可疑的病原菌，没有其他方法能超越16S rRNA 序列分析的优点。每种细菌都有16S rRNA，可通过PCR扩增、克隆、测序的技术，获得新的病原体信息。对那些正常情况下无菌的部位或体液标本，优势更明显[19]。对怀疑细菌感染的患者，如能从血液或脑脊液标本中应用16S rRNA技术检测到细菌，则提示非常有可能是病原菌。但理论与实际还会有一定的差距。当从认为是无菌的血液标本中检测到医院内感染细菌，具体情况应具体分析。16S rRNA 序列分析的功能是发现线索，但不能轻易下结论。对消化道、呼吸道等标本来说，问题更复杂。因为这些部位有正常菌群，使用16S rRNA技术能检测到多种细菌，要确定哪一种细菌是病原菌，需做更多的工作[20,21]。发现新的病毒，需要的技术更复杂。病毒的基因组序列差异很大，不能像细菌那样使用共有的序列。

如果怀疑病原体是新的病毒或细菌，可使用宏基因组测序法，即对标本包含的所有DNA或RNA序列无选择地进行分析；然后建立数据库，删除背景序列，查找与某种病原体有同源性的序列[22-24]；最后，根据结果设计序列、检测标本，继而分离、培养、确定病原体。从理论上讲，这个策略是可行的，也有成功的例子，但实际情况要复杂得多。需建立系统的技术和方法，需要微生物学、生物信息学、流行病学研究者和临床医师的共同努力。

4 我国传染病预防控制实践呼唤新病原学科的发展

目前我国疾病预防和控制系统除已开始启动的网络实验室外，应对新病原的挑战基本上是扮演救火队的角色，即 “被动灭火”的工作模式。在许多情况下，火被扑灭了，但对传染源和传染链的认识不够清晰，总结和推广经验的机制不够有力。扑灭疫情主要靠体制力量、群众运动和有力的行政领导与支持，科技含量还有待凝练与提高。因此，在应对突发传染病或突发事件实际问题的同时，建议设置新病原学，开展对国内、外新发现病原微生物的基础理论研究，在更广泛的领域内加强新病原学的理论教学，提倡理论指导实践以及学科间的交叉。通过医学微生物学、生物信息学、生态学、流行病学等学科的交融，重点完成发现新病原、判断新病原与疾病流行的关联度以及危害预警等核心任务[25]。

新病原学的主要内容是发现新病原的策略、技术和手段，包括应用大通量核酸、蛋白检测和筛选技术，及时、准确发现新病原体的线索。通过建立新病原学学科，进一步弥合传染病预防控制、临床救治、基础研究三大系统间的“缝隙”，形成新的工作思路和模式，以提高发现新病原、研究新病原、预防和控制新病原的能力[26-28]。

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