人型支原体对人绒毛蜕膜组织TNF-α、IL-10及PGE2的影响

张群锋,黄余良,刘 珏,李梅清,周建斌

南华大学附属第二医院妇产科衡阳 421001

△男,1974年10月生,硕士,主治医师,研究方向:妇科疾病,E-mail:xiaofeng29@163.com

人型支原体(Mycoplasma hominis,Mh)是常见的性传播疾病病原体。通常情况下,Mh感染没有明显的临床症状,但在羊水中具有较高的检出率[1],目前认为其与早产关系密切[2-3]。绒毛蜕膜中的母体细胞具有独特的免疫学特性,它能通过多种机制抑制母体免疫系统对胎儿的排斥反应[4-5],同时,绒毛蜕膜对抗原刺激的敏感性较低,能抑制病原体所诱导的宫内炎症。作者对绒毛蜕膜组织中前炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-10(IL-10)及分娩的主要启动因子前列腺素2(PGE2)进行了检测,探讨Mh是否对绒毛蜕膜组织具有致炎作用。

1 材料与方法

1.1 M h的培养与灭活 Mh于含有体积分数10%小牛血清、酵母浸液的PPLO培养基中,37℃体积分数5%CO2条件下培养 24～48 h,生长至对数晚期后,14 000 r/m in离心10 min收集沉渣,用无菌PBS重悬浮。浓缩悬浮液的颜色改变单位(CCU)采用双份 10倍稀释肉汤加以计算。剩余菌悬液置于 56℃20 min以灭活Mh。灭活的Mh再次接种于肉汤培养基和琼脂固体培养基加以验证,经验证后将灭活的Mh于-70℃储存备用。

1.2 实验分组 绒毛蜕膜组织来自5名选择性剖宫产的健康孕妇,均知情同意。胎盘分娩后,获取150 cm2的胎膜,用生理盐水漂洗以去除残留血液,手工去除羊膜后,用活检穿孔器将蜕膜组织剪成直径为6mm的碎片。随后将所有组织放入 6孔板中,每孔 6块,加入 4 mL含体积分数 10%胎牛血清、Hepes、β-巯基乙醇、L-谷氨酰胺及庆大霉素的IMDM培养基,于37℃体积分数5%CO2条件下培养 24 h。次日去除培养基,分 5组培养,分别加入PPLO培养基(阴性对照组)、终浓度为 102、104、106CCU/m L的Mh浓缩悬浮液(Mh低、中及高浓度组)及5 g/L脂多糖(阳性对照组),0、6、24、36和 48 h后,每孔弃去500μL培养液,加入等体积(终浓度为20mg/L)酮洛芬后,将6孔板连同其内培养细胞置于-70℃保存,用于TNF-α、IL-10及PGE2测定。

1.3 ELISA法检测TNF-α、IL-10及PGE2刺激结束后,将 6孔板于 -70℃反复冻融 2次以充分裂解细胞,5 000 r/min离心5m in后取上清液(包含细胞内和先前分泌至胞外的总细胞因子)储存于-70℃保存。TNF-α、IL-10和PGE2检测按照晶美公司的ELISA试剂盒说明书进行。实验重复3次。1.4 统计学处理 使用SPSS 13.0进行统计学处理,对 5组同一时间点以及同一组不同时间点人绒毛蜕膜组织TNF-α、IL-10和PGE2检测结果进行单因素方差分析,两两比较用LSD-t检验,检验水准α=0.05。

2 结果

不同浓度Mh作用于绒毛蜕膜组织后,蜕膜组织中TNF-α、IL-10及PGE2水平见表1～3。

表1 TNF-α检测结果(n=3) ng/L

表2 IL-10检测结果(n=3) ng/L

表3 PGE 2检测结果(n=3) ng/L

3 讨论

作者从 5例正常妇女胎膜中获取绒毛蜕膜组织,它主要由母源免疫系统的蜕膜形成细胞、胎儿的结缔组织及滋养层细胞组成。蜕膜组织由非单一细胞系组成,因此能更好地模拟体内由多种反应性细胞组成的功能器官,减少混杂因素对实验的影响。

IL-6是前炎性细胞因子,常常用作反映宫内炎症的重要指标[6],羊水以及胎儿血液中 IL-6增高能在一定程度上预测早产的发生。但 IL-6产生时间较迟,同时也不具有特异性[7],故此次实验未将 IL-6作为检测指标。TNF-α主要由巨噬细胞产生并介导前炎性反应,并且半衰期比较短。抑炎因子 IL-10是TNF-α诱导巨噬细胞产生的细胞因子,也可由炎症抗原直接诱导,它在维持炎症平衡过程中起十分重要的作用[8]。

作者发现Mh和脂多糖刺激蜕膜组织后,TNF-α的产生最快,其后为IL-10和PGE2。这与理论上的炎性刺激后细胞因子的产生顺序相同[9]。诱导蜕膜产生炎症反应需要较高浓度的Mh抗原(阈值),但实验中无法绘制完整的Mh-TNF-α剂量依赖曲线,因为培养基内Mh抗原浓度无法达到相应的要求。

Mh能在羊水中长时间寄生,并无明显临床症状,可能与其毒力较低有关。作者的研究结果显示,对于抗炎作用强的蜕膜组织而言,低剂量的 Mh可能并不能诱发相应的炎症反应,大剂量的 Mh才能诱导明显的TNF-α产生。另外可能的原因是Mh诱导的炎症反应机制可能与其他细菌有所不同[10]。某些细菌或抗原从下生殖道到达子宫后,如果蜕膜组织产生过强的炎症反应对妊娠不利,这可能是蜕膜组织存在刺激阈值且抗炎效应是非特异性的原因。

[1]PerniSC,Vardhana S,Korneeva I,et al.Mycop lasmahominis and Ureap lasma urealyticum in midtrimester amniotic fluid:association with amniotic fluid cytokine levels and pregnancy outcome[J].Am J Obstet Gynecol,2004,191 (4):1 382

[2]Novy MJ,Duffy L,Axthelm MK,et al.Multiplex PCR testing detected higher than expected rates of cervicalMycoplasmas, Ureaplasmas,Trichomonas and viral agents in sexually active Australian women[J].Reprod Sci,2009,16(1):56

[3]Wenman WM,Tataryn IV,Joffres MR,et al.The Edmonton Perinatal Infections Group.Demographic,clinical andmicrobiological characteristics ofmaternity patients:a Canadian clinical cohort study[J].Can JInfect Dis,2002,13(5):311

[4]Mellor AL,Munn DH.Immunology at thematernal-fetal interface:lessons for T cell tolerance and suppression[J]. Annu Rev Immunol,2000,18:367

[5]HolstRM,Jacobsson B,Hagberg H,etal.Cervical length in women in preterm labor with intact membranes:relationship to intra-amniotic inflammation/microbial invasion, cervical inflammation and preterm delivery[J].Ultrasound Obstet Gynecol,2006,28(6):768

[6]Maxwell NC,Davies PL,Kotecha S.Antenatal infection and inflammation[J].What's New,2006,19(3):253

[7]Jacobsson B,Mattsby-Baltzer I,Hagberg H.Interleukin-6 and interleukin-8 in cervical and amniotic fluid:relationship tom icrobial invasion of the chorioamniotic membranes [J].BJOG,2005,112(6):719

[8]PararasMV,SkevakiCL,Kafetzis DA.Preterm birth due tomaternal infection:Causative pathogens and modes of prevention [J].Eur JClin Microbiol Infect Dis,2006,25(9):562

[9]Figueroa R,Garry D,Elimian A,et al.Evaluation of amniotic fluid cytokines in p reterm labor and intactmembranes [J].JMatern Fetal Neonatal Med,2005,18(4):241

[10]Peltier MR,Freeman AJ,Mu HH,et al.Characterization and partial purification of a macrophage-stimulating factor from Mycop lasma hominis[J].Am J Reprod Immunol, 2005,54(6):342