高温高压抗原修复法提高乳腺癌免疫组化准确率的应用研究

郭秀芳

高温高压抗原修复法提高乳腺癌免疫组化准确率的应用研究

郭秀芳

目的 探讨免疫组化反应中的高温高压抗原修复法预处理方法对反应结果的影响。方法对 60份经10%中性甲醛液固定过的乳腺癌组织,经脱水、石蜡包埋制成切片,分别采用高温高压抗原修复法和微波炉抗原修复法做预处理后,进行免疫组化染色。结果 石蜡组织切片免疫组化反应预处理,采用高温高压抗原修复法,其阳性率为 55.8%,采用微波炉抗原修复法,其阳性率为 45.4%。免疫组化反应中采用高压高温抗原修复法作预处理,石蜡组织切片阳性表达率较微波炉抗原修复法明显提高(P＜0.05)。结论 预处理采用高温高压抗原修复法,提高了免疫组化阳性率的表达,显色对比鲜明,背景干净清晰,从而提高病理诊断的准确率。

高温高压抗原修复法;免疫组织化学技术;组织预处理

免疫组化已成为现代病理诊断中不可缺少的检测技术,特别是在判断肿瘤组织的来源、分类以及良恶性肿瘤的鉴别诊断等方面起着重要作用[1],但是免疫组化的不稳定性常常困扰着免疫组化的工作人员,送检组织经过甲醛固定抗原决定簇被醛基交联封闭,无法有效地与抗体结合而显示出来,从而大大影响了免疫组化的结果[2],为提高标本中抗原检测阳性率,我科从 2004年应用高温高压抗原修复法,用PBS抗原修复液对乳腺癌的组织切片的雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、P53、Ki67进行检测,方法介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料 本科室近期已确认乳腺癌 60份组织块,切片厚度3μm。试剂：第一抗体为兔抗人 ER单克隆抗体,兔抗人 PR单克隆抗体,兔抗人P53单克隆抗体,兔抗人 Ki67单克隆抗体。第二抗体为快捷免疫组化 Maxvision TM检测试剂盒,即用型单克隆抗兔 KIT5006(均购于福州迈新生物技术开发有限公司,直接使用,无需稀释),新鲜配制的 pH值为 7.4的PBS液为缓冲液。仪器：医用可调控电炉 2 000 kW,市售不锈钢高压锅直径 16 cm,750W National微波炉 1台。

1.2 方法 (1)前期准备：包括组织即时充分固定,合理取材,适宜的石蜡包埋,薄而完整均匀的切片,用经过APES防脱片剂处理过的载玻片捞出平整而无气泡的组织片进行免疫组化染色;(2)烘片：在 58～60℃恒温箱中烘片 2～4 h;(3)切片常规脱蜡,梯度乙醇、蒸馏水洗;(4)3%H2O2溶液浸泡 5～10 min,以抵制内源性过氧化物酶,蒸馏水洗 3次,每次 2min;(5)切片置于盛有 PBS缓冲液的高压锅或微波炉中;前者,高压锅内盛PBS液放于电炉上,烧至 95℃(有小气泡连续上冒)把盛有组织切片的立式染色架平放于 PBS液中(这样可节省 PBS液)使PBS液浸没染色架,盖上锅盖,待锅内水沸腾至高压锅盖顶的出气口喷气后即可达到工作温度和工作压力,持续 2min移开火源,待高压锅内气泄放完后打开锅盖自然冷却至室温。后者,加热 5m in(医用微波炉)自然冷却,再加热 5m in,取出容器,冷却容器,抗原修复后的切片用PBS液洗 3次,每次 5min;(6)10%正常兔血清 37℃孵育 30min;(7)用 PBS液洗 3次,每次 5min,滴加第一抗体 37℃孵育 1 h;(8)PBS液洗 3次,每次5min,滴加第二抗体 37℃孵育 30min;(9)PBS液洗 3次,每次5min,DAB显色,苏木素复染封片;(10)将 60份乳腺癌组织蜡块,分别用高温高压修复法和微波炉法进行抗原修复。

1.3 统计学分析 计数资料采用χ2检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

高温高压抗原修复法处理后的乳腺组织切片,细胞核呈褐色,阳性物质定位准确,阳性与阴性对比明显,细胞结果与细胞轮廓完整清晰,其阳性率明显高于微波炉抗原修复处理的切片,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表 1。

3 讨论

目前进行的常规蜡切片标本,一般均用甲醛固定,致使许多抗原决定簇被醛基交联封闭,以至于无法和抗体结合[3],其原因为：(1)在甲醛固定过程中形成的醛键而封闭了部分抗原决定簇;(2)甲醛在保存过程中会形成羧甲基,而封闭抗原决定簇;(3)在用固定剂固定时,会使蛋白与蛋白之间交联,也可能会封闭抗原决定簇。抗原修复是影响染色效果的最关键因素,不同抗原修复方法直接影响免疫组化染色结果的表达[4,5]。酶修复法是最早的抗原修复方法,但目前热修复法在免疫组化中应用较广。热修复抗原其原理是加热使抗原性物质分子运动加剧,最终打破封闭的抗原决定簇的化学键和蛋白分子间的交联,使抗原暴露,达到修复的目的[6]。微波炉抗原修复法通过高频电磁波将组织中因交联性固定剂甲醛处理而形成的醛键打开,使抗原暴露,但微波辐射量不均匀,不同区域的组织所受的处理强度不一,从而出现不同区域染色深浅不一的现象。高温高压修复法由 Shin[7]首先报道,用以增进组织切片对 tau蛋白的免疫组化的染色。Bank falvi等[8]用高压锅对一些组织抗原进行修复试验,发现高压锅能使甲醛固定,石蜡包埋的组织抗原得到修复,其效果优于微波炉。高温高压修复法可使一些常规免疫组化反应呈阴性的组织抗原,经过处理后呈阳性表现,对不经处理即呈阳性的组织抗原,高温高压修复法可提高第一抗体的稀释度或缩短孵育时间,因而提高了病理诊断的准确率。

表1 高温高压抗原修复法与微波炉抗原修复法的比较 n=60,例

1 王伯法,李玉松主编.病理学技术.第 1版.北京：人民卫生出版社,2000.354.

2 李英敏,傅中斐,尤红煜.枸橼酸盐缓冲溶液在乳腺癌石蜡切片 ER、PR、PCNA检测中应用.河北医科大学学报,1998,19：307.

3 倪灿荣主编.病理学技术.第 1版.北京：人民卫生出版社,2000.6,368.

4 骆新兰,蔡秀珍,刘艳辉,等.不同的抗原修复条件对免疫组织化学染色结果的影响.中华病理学杂志,2005,34：52-54.

5 周小鸽,王鹏,陆鸣,等.加热抗原修复对内源性生物素蛋白结合物的影响及其对策.中华病理学杂志,2002,31：491-496.

6 唐志校,夏东,王敏,等.几种组织抗原修复技术的讨论.诊断病理学杂志,2002,9：55.

7 Shin RW.Hydrted autoclave pretreatment enhances TAU immunoreactivity in formalin fixed normal and Alzheimers disease brain tissues.Lab invest,1991,64：693.

8 Bankfalvi A,NavabiH,Bier B,etal.Wet autoc lave pretreatment for antigen retrieval diagnostic immunohistochemistry.JPathol,1994,174：223.

R 734.2

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1002-7386(2010)06-0674-02

054001 河北省邢台市第一医院病理科

2009-12-25)