化疗对非小细胞肺癌患者血清抗 Survivin抗体水平的临床研究

邹亚峰 王国臣

Survivin是新近发现的一种新的凋亡抑制蛋白(IAP),1995年,Altier利用效应细胞蛋白酶受体 1(EPR 1)cDNA在人基因组织库中筛选克隆出 Survivin基因。Survivin蛋白的组织分布特征有明显的细胞选择性,它表达于胚胎和发育的胎儿组织,不见于终末分化的正常成人组织(胸腺和生殖腺除外),但在体内外的分化组织、人类大多数肿瘤组织内有 Survivin蛋白的表达。该蛋白可被自身固有T细胞所识别,具有抗原性,血清中其抗体称为抗 Survivin抗体。目前,国内外综合治疗对非小细胞肺癌患者血清抗 Survivin抗体水平的临床研究甚少,多数为关于 Survivin蛋白与临床疗效的观察研究,且结论多由统计肿瘤患者的生存期,或体外实验研究得出,鲜有探索临床治疗与非小细胞肺癌患者血清抗Survivin抗体之间的相互关系的临床观察研究。本实验用通过用 ELISA法对非小细胞肺癌患者化疗前后血清中抗 Survivin抗体的测定,检测抗存活素抗体变化,观察治疗效果,从而指导临床治疗。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集 2007年 4月至 2008年 10月我院确诊的非小细胞肺癌患者 260例(非小细胞肺癌组),其中男 158例,女 102例;年龄 20～78岁,平均年龄 59.14岁;其中腺癌 140例,鳞癌 120例。TNM分期Ⅱ期 20例,ⅢA期 100例,ⅢB期30例,Ⅳ期 110例。25～50岁的健康体检者 68例(对照组),男 49例,女 19例。所有患者采集清晨空腹静脉血 2ml,离心,3 000 r/min,10min,取上清液,-20℃冻存。260例非小细胞肺癌患者血清标本(非小细胞肺癌组),以及经ELISA法检测后证实为抗 Survivin抗体阳性的 65例化疗患者每周期化疗后 1周采血经离心后的血清标本(化疗组)和对照组 68例的血清标本。

1.2 化疗方案 吉西他滨第 1、8天静脉点滴,1 000mg/m2,顺铂第 1～3天静脉点滴,30 mg/m2。21 d为 1周期,共 4个周期。

1.3 实验试剂 人抗Survivin抗体/生存蛋白(SurvAb)酶联免疫分析试剂盒。

1.4 检测方法 血清抗 Survivin抗体浓度测定采用酶联免疫吸附双抗体夹心法,严格按说明书实验步骤操作,450 nm光波检测吸光度。

1.5 计算 以标准物的浓度为横坐标(对数坐标),OD值为纵坐标(普通坐标),在半对数坐标纸上绘出标准曲线根据样品的OD值,由标准曲线查出相应的浓度,再乘以稀释倍数;或用标准的浓度与 OD值计算出标准曲线的回归方程,将样品的OD值代入方程式,计算出样品的浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。

1.6 统计学分析 应用 SPSS 13.0统计软件,计量资料以±s表示,采用 t检验,计数资料采用 χ2检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组不同性别抗 Survivin抗体检测结果 抗 Survivin抗体男 1.3857±0.0822,女 1.4179±0.0884,对照组不同性别抗 Survivin抗体表达比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 对照组和非小细胞肺癌组 抗Survivin抗体测量结果比较 抗 Survivin抗体对照组中检测结果均为阴性,非小细胞肺癌组中阳性 134例,表达率 51.5%,其表达量明显高于对照组(P＜0.05)。见表 1。

表 1 2组 Survivin抗体检验结果比较 例(%)

2.3 化疗组化疗前后抗 Survivin抗体测量结果 化疗组化疗前与化疗 1周期 Survivin抗体表达两者比较差异无统计学意义(P＞0.05),4个周期化疗期间抗 Survivin抗体表达,1周期与2周期比较差异有统计学意义(P＜0.05),2周期与 3周期比较差异有统计学意义(P＜0.05)。3周期与 4周期比较差异无统计学意义(P＞0.05),见表 2。

表 2 化疗组化疗前后抗存活素抗体测量结果n=65,±s

表 2 化疗组化疗前后抗存活素抗体测量结果n=65,±s

注：与化疗 1周期比较,＊P＜0.05;与化疗 2周期比较,#P＜0.05

化疗组 抗 Suvnivin化疗前 2.49±0.71化疗 1周期 2.42±0.54化疗 2周期 1.95±0.44＊化疗 3周期 1.60±0.28＊#化疗 4周期 1.46±0.26＊#

3 讨论

Survivin是新近发现的一种新的凋亡抑制蛋白(IAP),1995年,Altier利用效应细胞蛋白酶受体 1(EPR 1)cDNA在人基因组织库中筛选克隆出Survivin基因[1],Survivin基因全长 15kb,位于 17q25,由分子大小为 1.9kb的 mRNA所编码,是一个 143个氨基酸的蛋白,它不仅含有单一的杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列(BIR)功能区、而且没有环指结构[2]。Survivin与其他凋亡因子不同,除参与凋亡的控制外,还特异地在细胞周期G 2/M期表达,通过与细胞有丝分裂纺锤体的微管结合,参与对细胞基因转录的调节。Survivin依赖细胞增殖信号介导而进入核内,与细胞周期调节子 Cdk4结合,导致 Cdk2/Cyclin的激活和 Rb磷酸化,Survivin/Cdk4的形成使 P21释放[3],P21通过紧密结合于 G1期和 S期的蛋白激酶(cyclin D 1-Cdk4和 Cyclin ECdk2),抑制其活性,对细胞增殖停留在 G1期具有重要的重用,P21的解离使 Cdk 4活化,细胞进入增殖周期,最终导致大量细胞无限制增殖。

Survivin蛋白的组织分布特征有明显的细胞选择性,它表达于胚胎和发育的胎儿组织,不见于终末分化的正常成人组织(胸腺和生殖腺除外),但在体内外的分化组织、人类大多数肿瘤组织内有 Survivin蛋白的表达[4]。该蛋白可被自身固有 T细胞所识别,具有抗原性,血清中其抗体称为抗Survivin抗体。癌细胞的 Survivin过表达可导致抗Survivin抗体和细胞毒性 T-淋巴细胞抗癌反应[5,6]。目前,Survivin的基因表达情况可以通过分子生物学、免疫组化、血清抗Survivin抗体等多种方法检测,但前两种方法由于操作复杂繁琐,不易在临床上推广,而血清学方法由于具有操作简单,重复性好,不需要蜡块等优点,在临床上已见报道。2000年 Rohayem等[6]首先报道了用ELISA法检测肺癌和结直肠癌患者血清中的抗Survivin抗体,其中肺癌患者 51例,结直肠癌患者 49例,在其实验中,肺癌患者抗Survivin抗体阳性,阳性率为 21.6%(11/51),结直肠癌患者抗Survivin抗体阳性,阳性率为 8.2%(4/49)。并且发现抗Survivin抗体在肺癌患者中有相当高的流行率,令人感兴趣的是在肺癌的细胞株中 Survivin的表达水平尤其高。因此Survivin可以被认为是一种主要的肿瘤抗原[7]。国内董德琼等[8]报道用酶联免疫吸附试验检测非小细胞肺癌患者血清中的抗Survivin抗体 34例,抗Survivin抗体阳性率为 32.5%(11/34),高于21.6%的阳性率的报道,且有治疗后较治疗前有明显下降。以高于对照组均值 2个标准差作为非小细胞肺癌抗Survivin抗体阳性的诊断标准。我们在本实验中,收集了 260例非小细胞肺癌患者治疗前的血清,所有患者均符合世界卫生组织/国际肺癌学会(WTO/LASLA)肺和胸膜肿瘤组织学分类标准[9],用酶联免疫吸附双抗体夹心法检测其血清中的抗Survivin抗体,其阳性率为 51.5%(134/260,手术组 69,化疗组65例),高于以往报道,可能与我们所用的试剂有关。为了便于比较治疗前后抗 Survivin抗体的变化,我们剔除了抗体阴性的非小细胞肺癌患者及未经治疗者,其中 65例行化疗,吉西他滨 +顺铂,4个周期。实验结果以高于对照组均值 2个标准差作为非小细胞肺癌抗 Survivin抗体阳性的诊断标准：1.3946+2×0.0846=1.56 U/ml。健康对照组全部阴性,Survivin在正常组织中不表达。这表明检测非小细胞肺癌患者血清中的抗Survivin抗体,用于肺恶性疾病的诊断及鉴别诊断具有一定的特异性。

在化疗组中,非小细胞肺癌患者 65例,化疗前抗体水平2.4865±0.7149,化疗 1周期后 1周,抗体水平为 2.4215±0.5357,化疗 2周期后 1周测抗体,抗体水平为 1.9522±0.4370,抗 Survivin抗体 3周期后测 Survivin抗体,抗体水平为1.6026±0.2838,抗 Survivin抗体阴性 24例,占 36.8%(24/65)。4周期后测 Survivin抗体,抗体水平为 1.4597±0.2561,由此可见,非小细胞肺癌患者抗Survivin抗体阳性患者,随着化疗周期的延长,其抗体水平逐步下降,考虑：(1)与化疗药杀灭肿瘤细胞,减小肿瘤负荷,减少血源性播散有关。(2)抗 Survivin抗体阳性的非小细胞肺癌患者,随着化疗周期的延长,其抗体水平逐步下降,与化疗药的时间-剂量相关。2006年的Pignon等[10]的 LACE(肺癌含铂辅助化疗评估)荟萃分析,对 5项随机对照试验,共 4 584例患者,所有的荟萃分析显示：顺铂为主的辅助化疗显著延长了患者的生存期,获益的程度与肿瘤的期别相关,并首次确定了顺铂剂量的重要地位,其中剂量必须超过300mg。化疗组中,65例非小细胞肺癌患者均经 4个周期的化疗,其顺铂总剂量均大于 300mg。通过 4个周期的化疗,该组化疗患者,抗 Survivin抗体总的水平有所下降,说明抗Survivin抗体的高表达与 Survivin高表达可导致细胞凋亡与细胞增殖失控具有一致性,可能是非小细胞肺癌细胞对化疗药物产生耐药进而恶性增殖的原因。Olie等[11]研究发现,利用Survivin反义核酸技术,可使肿瘤细胞 Survivin mRNA减少而caspase-3活性增加,促进肿瘤细胞凋亡,并增加肿瘤细胞对化疗药物敏感性。

1 AmbrosiniG,Adida C,Sirugo G,et al.Induction of apoptosisand inhibition of cellproliferation by survivin gene targeting.BiolChem,1998,273：11177-11182.

2 AmbrosiniG,Adida C,Altieri DC.A novel anti-apoptosis gene,survivin,expressed in cancer and lymphoma.Nat Med,1997,3：917-921.

3 Suzuki A,Ito T,Kawano H,et al.Survivin initiates procaspase 3/p21 complex formation as a result of interaction with Cdk4 to resist Fas-mediated cell death.Oncogene,2000,19：1346-1353.

4 Takahashi R,Deveraux Q,Tamm I,et al.A single BIR domain of XIAP sufficient for inhibiting caspases.Biol Chem,1998,273：7787-7790.

5 Schm itz M,Diestelkoetter P,Weigle B,et al.Generation of survivinspecific CD 8+T effector cells by dendritic cells pulsed with protein or selected peptides.Cancer Res,2000,60：4845-4849.

6 Rohayem J,Diestelkoetter P,Weigle B.et al.Antibody response to the tumor-associated inhibitor of apoptosis protein survivin in cancer patients.Cancer Res,2000,60：1815-1817.

7 Tamm I,Wang Y,Sausville E,et al.IAP-family protein survivin inhibits caspase activity and apoptosis induced by Fas(CD 95),Bax,caspases,and anti-cancer drugs.Cancer Res,1998,58：5315-5320.

8 董德琼,杨渝浩.非小细胞肺癌患者血清抗-Survivin抗体、P53抗体水平的研究.贵州医药,2005,29：969-970.

9 钟雪云.肺和胸膜肿瘤的病理组织学新分类.中国肿瘤,2000,9：129-130.

10 Pignon JP,Tribodt H,Scagliotti GV,et al.Lung Adjuvant Cisplatin Evaluation(LCAE)：a pooled analysis of five random ized clinical trials including 4584 patients.Proc Am Soc Clin Onocol,2006,18：s336.

11 OlieRA,Simoes-WustAP,Baumann B,et al.A novel antisense oligonucleotide targeting survivin expression induces apoptosis and sensitizes lung cancer cells to chemotherapy.Cancer Res,2000,60：2805-2810.