番鸭细小病毒XX株VP2基因的克隆和序列分析

宋永峰 周 丽 钟锦伦 宋延华 温纳相

（广东温氏食品集团研究院 新兴 527400）

番鸭细小病毒XX株VP2基因的克隆和序列分析

宋永峰 周 丽 钟锦伦 宋延华 温纳相*，

（广东温氏食品集团研究院 新兴 527400）

根据国内外已发表的番鸭细小病毒(MDPV)FM株和GD株基因序列，应用DNAstar分子生物学软件设计1对引物，应用PCR技术扩增MDPV XX株的结构蛋白基因VP2全基因片段。将扩增得到的VP2全基因克隆到PGEM-T easy载体上，经菌液PCR鉴定后的重组子进行序列测定。结果表明，MDPV XX株基因大小为1764bp，编码587个氨基酸，其基因序列与国内外发表的FM株、GD株核苷酸序列同源性分别为98.4%和99.8%，而与同属的小鹅瘟病毒B株核苷酸同源性仅为78.2%。可见编码番鸭细小病毒结构蛋白的VP2基因较保守，且和同属的小鹅瘟病毒明显不同，这也是该病毒目前只有一个血清型的分子基础。

番鸭细小病毒 VP2基因 克隆 序列分析

*通讯作者

番鸭细小病毒(MDPV)病是近年来在国内外番鸭养殖中普遍流行的一种急性败血性传染病[1-3]。该病以番鸭消化道，尤其是小肠的病变为主要特征，传播快，发病率、死亡率都很高，是造成番鸭养殖中经济损失的主要传染病之一[4]。

其病原—MDPV为细小病毒科细小病毒属成员，为单股、线性DNA病毒。基因组大小约为5kb，编码区含有2个开放阅读框架(ORF)[5]，其中右侧ORF编码3种结构蛋白,即VP1 、VP2 、VP3。三者共用同一终止密码子，起始密码子各不相同，其分子质量由大到小排列依次为VP1 、VP2 、VP3[6-8]。其中VP2 结构蛋白具有免疫原性，是病毒刺激机体产生保护性抗体的重要抗原蛋白[9]。MDPV-XX株是从具有典型临床症状和病理变化的雏番鸭体内分离得到的野毒, 本研究克隆了MDPV-XX 株VP2基因，并与GenBank中收录的MDPV FM株、GD株，GPV B株进行了核苷酸同源性比较，为进一步研究MDPV的分子生物学特性和VP2基因的生物学活性等奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 病毒

MDPV新兴株(Xinxing，XX)由本实验室分离自某发病番鸭群，病鸭表现为精神萎靡，食欲不振，软脚，呼吸困难，拉灰白色或淡绿色粪便；剖检可见回肠膨大，内含大量炎性渗出物或脱落的肠黏膜。

1.2 载体与菌株

PGEM-Teasy载体克隆试剂盒购自TaKaRa公司，感受态细胞JM109、DH5α由本实验室制备并保存。

1.3 试剂

Tissue DNA Kit 购自OMEGA公司，Premix TaqTM (Ex TaqTM Version)、DNA Marker DL2000购自TaKaRa公司，UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工，X-gal、IPTG购自Promega公司，常规试剂均为国产或进口分析纯产品。

1.4 引物的设计与合成

根据已发表的MDPV参考毒株FM株、GD株等毒株的全基因序列，利用DNAstar软件设计1对扩增VP2全基因的引物MDPVF/R，预期扩增片段大小为1764bp。上游引物MDPVF：5'-ATGGCTCCTGCTAAAAAG -3'，下游引物MDPVR：5'–GGCGAAATTTACAGATTCTGAGTC -3'，引物由Invitrogen合成。

1.5 DNA提取、PCR扩增

按照Tissue DNA Kit说明书操作从样品中提取DNA，以DNA为模板进行PCR扩增，25µl反应体系如下：12.5µl Premix Taq、8.5µl ddH2O、MDPVF/ R 各1µl 、2µl DNA模板。PCR扩增条件：95℃ 5mins,94℃ 50s,42℃ 50s,72℃90s,30个循环，72℃ 10mins。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行分析鉴定。

1.6 目的基因的克隆与鉴定

用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒纯化PCR产物，将所得的PCR纯化产物与pGEM-T easy 载体按照说明书操作进行连接。连接产物转化DH5感受态细胞，蓝白斑筛选重组子。挑取白色菌落，于LB液体培养基(Amp+)中进行过夜培养，常规方法进行菌液PCR鉴定。

1.7 目的基因序列测定

将菌液PCR鉴定为阳性的含重组质粒的菌液送往大连宝生物公司进行序列测定。

1.8 序列分析

利用DNAstar分子生物学软件，将测出的核苷酸序列与GenBank已发表的MDPV及GPV参考毒株序列进行比较分析。

2 结果

2.1 PCR扩增结果

应用引物MDPVF/R对MDPV XX分离株核酸进行PCR扩增，结果可以扩增到大小约为1800bp的特异性条带，与预期结果相符（见图1）。

2.2 重组质粒的鉴定

将目的基因克隆到pGEM-T easy 载体中，挑取白色菌落，于LB液体培养基（Amp+）中进行过夜培养,常规方法进行菌液PCR鉴定。结果应用PCR可以扩增到一条约为1800bp的特异性条带(见图2)，说明MDPV-XX株 VP2基因已经被成功克隆。

2.3 序列测定及分析比较

测序结果表明:MDPV XX株VP2 基因大小为1764 bp,编码588个氨基酸。应用DNAstar软件将MDPV-XX株VP2基因序列与MDPV参考毒株FM株、GD株及GPV参考毒株B株VP2基因进行核苷酸同源性比较，发现MDPV-XX株VP2基因与MDPV FM株相比，有29个核苷酸发生改变，并使14个氨基酸发生改变；与MDPV GD株相比，有4个核苷酸发生改变，使3个氨基酸发生改变；其核苷酸同源性分别为98.4%和99.8%，对应的氨基酸同源性为97.2%和99.3%。而与同属的GPV参考毒株B株的核苷酸同源性仅为78.2%，对应的氨基酸同源性为87.6%（见图3）。

图1 MDPV XX株 VP2基因PCR扩增

图2 菌液PCR鉴定

图3 MDPV-XX株与MDPV FM株、GD株,GPV B株VP2基因推导的的氨基酸序列比较

3 讨论

（1）VP2基因编码的结构蛋白是病毒刺激机体产生保护性抗体的重要蛋白抗原[9]。2000年，娄华等[10]首次对番鸭细小病毒的抗原性蛋白基因进行序列测定。笔者根据genBank 中发表的MDPV基因序列，应用DNAstar软件设计一对VP2基因扩增引物MDPVF/R，应用PCR技术成功获得了MDPVXX株VP2基因并亚克隆到PGEM-Teasy载体中，为下一步研究VP2基因的结构、功能奠定了基础。

（2）MDPV XX株VP2 基因大小为1764 bp，应用DNAstar软件进行序列分析，MDPV XX株VP2基因与国内外MDPV分离株FM株、GD株核苷酸同源性非常高，分别达到98.4%和99.8%，这说明番鸭细小病毒的结构蛋白基因保守性较高，这也使目前该病毒只有一个血清型的分子基础。而与同属的GPV参考毒株B株的核苷酸同源性仅为78.2%，具有明显不同。

[1] B W 卡尔尼克松, 禽病学[M].第11版.[出版社不祥]2005.

[2] Takehara K,Hyakutake K,Imamura T,et al. Avi.Dis.,1994,38:810-15.

[3] 殷震,刘景华. 动物病毒学[M]. 第2版,北京:科学出版社,1997.

[4] Glavits R,Zolnai A,Szabo E,et al. Comparative pathological studies on domestic geese (Anser anser domestica) and Muscovy ducks (Cairina moschata) experimentally infected with parvovirus strains of goose and Muscovy duck origin[J]. Acta Vet Hung,2005, 53(1): 73-89.

[5] 季芳，张毓金，杨增岐等.番鸭细小病毒和鹅细小病毒广东株VP1基因的克隆与序列分析[J].中国预防兽医学报,2004,26(4):245-246.

[6] Le Gall-Recule G,Jestin V.Biochemical and genomic characterization of Muscovy duck parvovirus[J].Arch Virol,1994,139:121-131.

[7] 陈晓月，赵承辉，章金刚等.番鸭细小病毒国内分离株主要结构蛋白基因的克隆和序列分析[J].中国家禽,2006,28(24):9-12.

[8] Chun-Yen CHU ,Ming-Jeng PAN ,Jiin-Tsuey CHENG.Genetic Variation of the Nucleocapsi of Waterfowl Parvovirus[J].J Vet Med Sci ,2001 ,63 (11):1165-1170.

[9] Wang C Y,Shieh H K,Shien J H,et al. Expression of capsid proteins and non- structural proteins of waterfowl parvoviruses in Escherichia coli and their use in serological assays[J]. Avian Pathol, 2005, 34(5):76-82.

[10] 娄华，白挨泉，顾万军等.番鸭细小病毒MDPV-Q株VP2蛋白基因的克隆与序列测定[J].中国预防兽医学报,2001,23(1):4-6.

S852.65+9.2

A

1007-1733(2010)04-0003-03

2009–12–23）

疾病防治