从废弃啤酒酵母提取乙醛脱氢酶的研究

毛跟年， 李 鑫， 瞿建波， 郭 倩

(陕西科技大学生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

0 前言

乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase, ALDH)广泛存在于真核生物和原核生物中，在辅酶I存在的条件下，它催化包括乙醇在内的某些一级或二级醇、醛和酮的脱氢反应[1].在人类和其他许多动物体内，线粒体乙醛脱氢酶能转化对生物体有害的醇类，所以在细胞解毒研究中乙醛脱氢酶受到了高度关注[2].同时，乙醛脱氢酶在分子生物学以及与其相关疾病的检测方面也多有应用.因此，乙醛脱氢酶的研究具有重要的理论意义和应用价值.

作者探讨了从废弃啤酒酵母中提取乙醛脱氢酶，将冻融与超声波相结合破碎细胞，并对提取过程的一系列因素进行了考察，确定了提取乙醛脱氢酶的最佳工艺条件.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

JY92-2D超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技有限公司)，752紫外可见分光光度计(上海光谱仪器公司),牛血清白蛋白(陕西化玻器械有限公司)，辅酶I(Roche公司)，废弃啤酒酵母(西安蓝马啤酒有限公司提供)，其他试剂均为市售，纯度为分析纯.

1.2 方法

1.2.1 蛋白质测定

采用考马斯亮兰染色法，以考马斯亮兰G250为蛋白结合物，在595 nm下比色，以牛血清白蛋白为标准品.

1.2.2 ALDH的测定

参考赵玉凤、雷明科[3]等3 mL反应体系：乙醛脱氢酶可以催化NAD+成为NADH，在340 nm辅酶NADH有明显吸收而氧化型NAD+无吸收，定义每分钟产生1 μmoL的NADH所需要的酶量为1个活力单位(U).

1.2.3 啤酒废酵母预处理方法

将收集的啤酒废弃酵母液先过120目筛子，除去酒花等大颗粒物质，然后加入0.5% NaHCO3洗涤0.5 h，除苦味，最后3 000 g离心弃上清液得酵母泥.

1.2.4 啤酒废酵母乙醛脱氢酶提取方法[4，5]

取经预处理的冷冻啤酒酵母，放入4 ℃账冰箱解冻12 h，然后用超声波细胞破碎仪在不同超声强度及不同提取时间、不同提取液浓度、不同料液比、不同提取液pH值下进行提取，然后在10 000 g下离心15 min，除去杂质，收集上清液并测定蛋白质含量及酶活.

2 结果与分析

2.1 单因素试验分析

2.1.1 不同料液比对乙醛脱氢酶提取的影响

取经预处理的冻融酵母10 g用0.01 M、pH 7.0的磷酸缓冲液分别稀释1,2,3,4,5倍，在低温(10 ℃以下)、超声功率200 W (超声3 s，间歇1 s)下提取10 min，10 000 g离心取上清液分别测定其蛋白质含量及酶活，其结果见图1.

图1 不同料液比对乙醛脱氢酶提取的影响图2 不同超声强度对乙醛脱氢酶提取的影响

由图1可见，酵母用量与提取液比率对乙醛脱氢酶的提取有一定影响，当料液比从1∶1增至1∶3时，提取液中蛋白质含量和乙醛脱氢酶活力明显增加；当继续增加至1∶4、1∶5时，提取液中蛋白质含量和乙醛脱氢酶活力增加不明显，基本趋于稳定.因此，料液比选择1∶3较合适.

2.1.2 不同超声强度对乙醛脱氢酶提取的影响

取经预处理的冻融酵母10 g与0.01 M、pH 7.0 的磷酸缓冲液按1∶3(w/v) 倍比率混合，在低温、超声功率分别为100 W、150 W、200 W、250 W、300 W、350 W和400 W的条件下提取10 min，离心取上清液分别测定蛋白含量及酶活，其结果见图2.

由图2可见，随着超声强度的增加蛋白质含量和酶活力呈增长趋势，说明超声功率对破碎效果有很大的影响，输出功率的增大有利于“空穴”作用的增强，从而使破碎效率增大，但超声功率超过350 W时酶活力表现出下降趋势，可能超声功率过大时影响了酶的空间结构.从图2可以看出，超声功率为350 W时酶活力最高.

2.1.3 不同超声时间对乙醛脱氢酶提取的影响

取经预处理的冻融酵母20 g与0.01 M、pH 7.0的磷酸缓冲液按1∶3比率混合，在低温、超声功率350 W下每间隔4 min停止超声，混匀提取液并取样5mL，离心取上清液分别测定蛋白质含量及酶活，其结果见图3.

图3 不同超声时间对乙醛脱氢酶提取的影响图4 不同提取液pH对乙醛脱氢酶提取的影响

由图3可见，蛋白质含量随时间的增加而增大，在破碎至36 min时蛋白质含量增加已不明显.在0～32 min之间，ALDH活力随时间的增加而增大；在36～48 min之间，ALDH活力随时间的增加而下降，说明超声波使部分酶失活.

2.1.4 不同提取液pH对乙醛脱氢酶提取的影响

取经预处理的冻融酵母10 g与0.01 M的不同pH磷酸缓冲液按1∶3比率混合，在低温、超声功率350 W下提取32 min，离心取上清液分别测定蛋白质含量及酶活，其结果见图4.

由图4可见，当提取液的pH从3.0增至4.0时，乙醛脱氢酶的活性显著升高，在pH 4.0处达到峰值，再增大pH至5.0，提取活性显著降低，继续增大提取液pH至9，则提取活性又随提取液pH的增大而逐渐升高，并在pH 8.5处达到第二个峰值，此后随pH的增大提取活性又迅速下降.可能是乙醛脱氢酶在不同pH下的溶解性和稳定性不同，导致其提取活性存在差异.

2.1.5 不同提取液浓度对乙醛脱氢酶提取的影响

取经预处理的冻融酵母10 g与pH 8.5的不同浓度的磷酸缓冲液按1∶3比率混合，在低温、超声功率350 W下提取32 min，离心取上清液分别测定蛋白质含量及酶活，其结果见图5.

图5 不同提取液浓度对乙醛脱氢酶提取的影响图6 提取次数对乙醛脱氢酶提取的影响

由图5可见，提取液浓度不同，对乙醛脱氢酶提取影响也很大，当提取液浓度低于0.05 mol/L时，随着提取液浓度的增大，乙醛脱氢酶的提取活性也呈增加趋势，在0.05 mol/L时达到最大；当提取液浓度高于0.05 mol/L时，提取活性随提取液浓度增加呈下降趋势.因此，提取乙醛脱氢酶以选择0.05 mol/L提取液浓度为宜.

2.1.6 超声提取次数对乙醛脱氢酶提取的影响

将经预处理的冻融酵母10 g与0.05 M、pH 8.5的磷酸缓冲液按1∶3比率混合，在低温、超声功率350 W下提取32 min，离心后所得上清液为第一次提取液.第二次、第三次提取时，方法与第一次相同，离心收集各次的上清液，测定其蛋白质含量及酶活力，结果见图6.

由图6可见，随着提取次数的增多，乙醛脱氢酶活力显著下降.超声前2次的提取活性占3次总提取活性的93.2%，第3次仅有6.8%，因此超声提取酵母乙醛脱氢酶以2次提取为宜.

2.2 正交试验分析

为了确定在多因素条件下的最佳超声强度、超声时间、提取液pH和提取液浓度与单因素试验结果是否吻合，进行了正交试验.以酶活力为考察指标，试验设计及正交试验结果见表1.

表1 L9(34)正交试验结果及极差分析

由表1极差分析结果可知，影响啤酒酵母乙醛脱氢酶提取的主要因素是超声功率，而提取液浓度影响较小，各因素的主次顺序是A>C>B>D,最优提取方案为A2B2C2D2，即以0.05 M、pH 8.5的磷酸缓冲液为提取液，在料液比1∶3(w/v)、超声功率350 W、超声提取时间32 min条件下所得酶活最高，这与单因素条件下的试验结果是相同的.按照最优提取方案进行验证试验，所得酶活力为11.2 U.

3 结论

(1)采用冻融-超声相结合的方法对啤酒废酵母中的ALDH进行提取，得到的最优工艺条件为：称取10 g经冻融处理的酵母，加入3倍体积0.05 M、pH 8.5的磷酸缓冲液，在超声功率350 W下超声3 s、间歇1 s，超声全程时间为32 min，操作温度控制在10 ℃以下.在此条件下，超声提取一次获得的酶活力最高，可以达到11.2 U/10 g废酵母.

(2)考虑到酵母细胞壁较厚和超声功率对酶活性的影响，提取应分多次进行.试验表明：在最优工艺条件下，超声提取2次就能够获得较好的效果.

参考文献

[1] Todd L. Kelson, Julie R. Secor McVoy, William B. Rizzo. Human liver fatty aldehyde dehydrogenase: microsomal localization, purification, and biochemical characterization[J]. Biochimica et. Biophysica Acta, 1997, 1 335: 99-110.

[2] Kwan-Hoon Moon, Mohamed A. Abdelmegeed, Byoung-Joon Song. Inactivation of cytosolic aldehyde dehydrogenase via S-nitrosylation in ethanol exposed rat liver[J]. FEBS Letters, 2007, 581:3 967-3 972.

[3] 赵玉凤,雷明科,吴元欣,等.酿酒酵母乙醛脱氢酶活性检测反应体系优化[J].中国酿造，2008,9:23-26.

[4] 吴桂英,吴元欣,赵玉凤,等.破碎酵母释放乙醛脱氢酶的研究[J].酿酒科技.2006,11:21-23.

[5] 姚洪文,郭素格,范玉梅.酵母细胞破碎技术的研究[J].中国酿造,2005,4:32-34.