大鼠子宫内膜异位症CD44的异常表达及意义

金海燕，周龙书

（广州医学院第二附属医院，广州 510260）

具有活性的子宫内膜组织出现在子宫内膜以外部位时称为子宫内膜异位症（Endometriosis,EMT），简称内异症。根据子宫内膜种植学说，经血中所含的子宫内膜碎片可随经血倒流，经输卵管进入腹腔，种植于卵巢和临近的盆腔腹膜，以致形成EMT[1]。腹膜表面覆盖着一层间皮细胞，可以分泌大量透明质酸乃至在间皮细胞周围形成一层包被，CD44正是透明质酸的受体，与细胞外基质中的透明质酸结合，参与子宫内膜细胞与腹膜之间的特异性黏附[2]。因此，本研究建立大鼠EMT模型，比较黏附分子CD44在EMT大鼠在位、异位内膜及正常子宫内膜中的表达，以探讨CD44在EMT发病中的作用和意义。

1 材料与方法

1.1 大鼠EMT模型的建立

健康雌性SD大鼠，体重200～240 g。经阴道涂片检查，在动情期建模。以2%戊巴比妥钠（40 mg·kg－1）腹腔麻醉。在尿道上端约 1 cm 处，沿腹部中线切开皮肤约3 cm，切下左侧子宫角长约1.5 cm，并行端端吻合术。在洛氏营养液中，将切下的子宫角纵向剖开，并将其内膜与肌层分离，切取5 mm×5 mm的内膜片段，令其表面上皮与腹壁相对，用无损伤6-0缝线将其四角缝于腹腔右侧腹壁上。缝合切口，常规饲养。对照组（假手术组）术程同建模组，只是不予缝合内膜片段于腹壁。

1.2 试验分组

建模组：建模后第4周，选择动情期，将建模成功的10只大鼠，摘出在位及异位子宫内膜组织。对照组（假手术组）：5只大鼠，于假手术后第4周，选择大鼠动情期，摘出子宫内膜组织。

1.3 免疫组织化学方法检测EMT组在位、异位内膜及对照组子宫内膜CD44的表达

标本进行石蜡包埋、切片，经微波炉抗原修复20 min后用链霉菌抗生物素蛋白－过氧化酶（S-P）法进行染色。采用DAB同步浸染显色法使所有切片显色时间相同[3]。试验设阳性对照及阴性对照。小鼠抗大鼠CD44（购自深圳先进技术工业有限公司）；S-P免疫组化通用试剂盒（购自Maxin Biotech公司），均为即用型。

1.4 图像分析

用阳性单位（Positive unit，PU）定量表达免疫组化阳性反应程度。将排除了切片本底因素后的纯免疫组化反应程度按灰度图像分为0～100个等级，每一个等级定义为1个PU。PU值大小与阳性反应程度成正比。在Leica Q550 IW图像分析系统上测试大鼠在位和异位子宫内膜腺上皮的灰度值Gα和背景的灰度值Gβ，按公式PU=[（Gα-Gβ）/Gmax]×100计算PU值。Gmax为检测仪器的最大灰度，等于256。每张染色片随机测试10个视场，相加后除以10，所得数值为该切片的阳性单位[4]。

1.5 统计学分析

用SPSS 10.0统计软件进行统计学分析。所有数据均用±S表示，EMT大鼠在位子宫内膜、异位内膜和对照组子宫内膜腺上皮之间的比较采用t检验。

2 结果与分析

2.1 大鼠EMT模型的形态学

大鼠EMT模型建模后第4周开腹，见移植的异位子宫内膜体积明显增大，生长良好，形成内有液体积聚表面有血管攀生的透明小囊泡，移植物组织学检查可见子宫内膜上皮细胞、腺体及间质细胞，证明建模成功。对照组大鼠假手术后第4周，未见移植物生长。

2.2 大鼠EMT模型异位内膜的超微结构

大鼠EMT模型异位的腺上皮很少见腺腔形成。分泌细胞游离面有短小稀疏的微绒毛，可见分泌细胞的微绒毛大片脱落（见图1）。纤毛细胞表面的纤毛短小、少见（见图2）。上皮细胞间隙囊状扩大，胞浆内线粒体体积增大，扩张呈球形，中央可见透亮无嵴区；还有少量粗面内质网、丰富的游离核糖体和高尔基体。细胞核位于细胞中部，核周腔扩大；核膜不规则；核染色淡，染色质分散，核仁明显。异位内膜腺上皮细胞可见凋亡现象，基底膜弯曲，间质细胞体积大，核染色稍淡。

图1 大鼠EMT模型异位的腺上皮分泌细胞的微绒毛大片脱落（×6890）Fig.1 In ectopic glandular epithelium in rat model with endometriosis,the microvilli on the free surface of secretory cells had shed(Original magnification:×6890)

图2 大鼠EMT模型异位的腺上皮纤毛细胞表面的纤毛短小（×5200）Fig.2 In ectopic glandular epithelium in rat model with endometriosis,the cilia of ciliated cells were short（Original magnification:×5200）

2.3 大鼠EMT模型组在位、异位内膜与对照组子宫内膜CD44的表达模式

CD44在大鼠子宫内膜的腺上皮细胞、腔面上皮细胞表达。CD44阳性细胞的细胞膜被染成棕黄色，胞浆内虽也有CD44表达，但着色比胞膜浅，一些腺体的腺腔内也充满了CD44阳性颗粒。大鼠EMT模型组在位、异位内膜与对照组子宫内膜CD44的表达模式见表1。

表1 大鼠EMT模型子宫内膜腺上皮CD44的表达Table 1 CD44 expression in control eutopic and ectopic endometrium from rats with endometriosis (±S)

表1 大鼠EMT模型子宫内膜腺上皮CD44的表达Table 1 CD44 expression in control eutopic and ectopic endometrium from rats with endometriosis (±S)

注：组间比较，数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P＜0.01）；不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）；字母相同且大小写也相同表示差异不显著（P＞0.05）。Note:To compare between the groups,values with different capital letters mean extremely significant difference(P＜0.01).Values with different small letters mean significant difference(P＜0.05).The same letters mean no significant difference(P＞0.05).

组别Group n CD44 对照组大鼠子宫内膜Endometrium from control rats 1 5 6.97±2.13Aa大鼠EMT模型组在位内膜Eutopic endometrium from rats with endometriosis 2 10 7.20±1.68Aa大鼠EMT模型组异位内膜Ectopic endometrium from rats with endometriosis 3 10 19.34±2.35Bb

由表1可以看出，大鼠EMT模型组在位内膜腺上皮CD44的表达（见图3）与对照组子宫内膜（见图4）无显著性差异（P＞0.05）。

图3 大鼠EMT模型组在位内膜CD44的表达（×400）Fig.3 Expression of CD44 in eutopic endometrium from rats with endometriosis(S-P×400)

图4 对照组大鼠子宫内膜CD44的表达（×400）Fig.4 Expression of CD44 in endometrium from control rats(S-P×400)

EMT模型组大鼠异位内膜腺上皮CD44的表达（见图5）高于对照组子宫内膜，差异极显著（P＜0.01）。EMT模型组大鼠异位内膜腺上皮CD44的表达高于同组的在位内膜，差异极显著（P＜0.01）。其中对照组大鼠子宫内膜CD44的PU平均值为6.97，大鼠EMT模型组在位内膜CD44的PU平均值为7.20，而大鼠EMT模型组异位内膜CD44的PU平均值为19.34。

图5 大鼠EMT模型组异位内膜CD44的表达（×400）Fig.5 Expression of CD44 in ectopic endometrium from rats with endometriosis(S-P×400)

3 讨 论

正常生理状态下，子宫内膜生长于子宫腔内壁，受卵巢激素调控，每月随月经来潮而剥脱后排出体外。当子宫内膜组织出现在子宫体以外部位时，称为EMT。EMT虽然是一种良性疾病，但生物学行为却如同恶性肿瘤，具有浸润破坏性和复发性等，使之成为难以治愈、危害颇大生殖系统疾病之一。居于子宫腔内的子宫内膜如何迁徙到机体的其他部位形成EMT，确切病因及发病机制至今尚不明确，且病程呈进行性加重，长期以来令人困惑。根据子宫内膜种植学说，逆流经血中的子宫内膜与腹膜接触并种植在其表面是形成EMT的主要途径。

CD44是一种细胞表面跨膜糖蛋白，通过细胞膜外受体与相应配体如透明质酸、胶原蛋白、纤粘蛋白、层粘蛋白等基质分子结合后，参与细胞－细胞、细胞－基质之间的特异性粘连，并与细胞骨架蛋白结合，参与细胞伪足形成，与细胞的迁移运动有关。

研究发现，子宫内膜在盆腹腔突破腹膜及器官“防线”，在“异域”生根、生长，必须经过粘附（Adhesion）－侵袭（Aggression）－血管生成（Angiogenesis）三部曲。子宫内膜细胞在盆、腹腔内与间皮细胞接触是形成异位病灶的第一步[5]。腹膜表面覆盖着一层间皮细胞，可以分泌大量透明质酸，CD44正是透明质酸的受体。CD44的表达增加，使脱落的细胞易于通过其配体透明质酸与腹膜表面的间皮细胞结合，并形成种植灶。由此可见，CD44表现出许多浸润和转移所需要的特性，它的异常表达可能与EMT的发生和转移有密切的关系。CD44在子宫内膜细胞与间皮细胞的相互作用中发挥非常重要的作用[6－7]。

本研究通过建立大鼠EMT模型，发现EMT模型大鼠异位内膜腺上皮CD44的表达显著高于EMT在位内膜及对照组子宫内膜。由腹膜间皮细胞产生的透明质酸与表达CD44的子宫内膜细胞黏附结合，是子宫内膜细胞在盆、腹腔种植形成EMT的机制之一，CD44表达增强的子宫内膜细胞表现出与间皮细胞很强的黏附性。CD44表达增强的子宫内膜腺上皮细胞是具有腹膜种植潜能的细胞，易与细胞外基质黏附，进而在异位处种植生长，种植能力与CD44的表达量有关，其在异位内膜中的异常表达可引起异位病灶的种植。

[1]乐杰.妇产科学[M].7版.北京:人民卫生出版社,2008:325-332.

[2]Griffith J S,Liu Y G,Tekmal R R,et al.Menstrual endometrial cells from women with endometriosis demonstrate increased adherence to peritoneal cells and increased expression of CD44splice variants[J].Fertil Steril,2010,93(6):1745-1749.

[3]廖剑辉.DAB同步浸染显色法在免疫组织化学中的应用[J].暨南大学学报,1996,17(1):55-56.

[4]申洪.免疫组织化学染色定量方法研究(Ⅲ)[J].中国组织化学与细胞化学杂志,1995,4(1):89-92.

[5]Klemmt P A,Carver J G,Koninckx P,et al.Endometrial cells from women with endometriosis have increased adhesion and proliferative capacity in response to extracellular matrix components:Towards a mechanistic model for endometriosis progression[J].Hum Reprod,2007,22(12):3139-3147.

[6]Li C Z,Liu B,We Z Q,et al.Inhibition of CD44expression by small interfering RNA to suppress the growth and metastasis of ovarian cancer cells in vitro and in vivo[J].Folia Biol(Praha),2008,54(6):180-186.

[7]Hasegawa A,Yoshino O,Osuga Y,et al.High soluble CD44concentration in peritoneal fluid in endometriosis[J].Fertil Steril,2008,89(5):1267-1268.