食道组织工程的研究进展与展望

李媛媛 刘玉新 竺亚斌 陈 玲 俞珺瑶

（宁波大学医学院，宁波 315211）

引言

在面对目前食道癌手术后带来的多种并发症（如吻合口瘘、狭窄、坏死、反流等诸多问题）的情况下，人们希望能够研制出一种与食道功能与形态一致的替代物。1993年，组织工程学正式提出以来，研究者们一直在探索用合适的支架材料与食道细胞相结合，构建组织工程化食道。随着各门学科技术（如生物材料学、生物反应技术及分子生物学等）的发展，组织工程化食道的研究也不断取得新的突破，它正朝着制作材料普遍、组织相容性高、创伤小、并发症少等方面发展，这使其必将在今后的临床应用上起到重要作用［1］。现将以食道组织工程的一个重要环节——支架材料为重点，对目前食道组织工程的研究现状及发展趋势作一综述。

1 用于构建组织工程化食道支架的基材

支架材料，作为组织临时基质，不仅为细胞组织提供支撑，在细胞附着、生长、增殖、组织或器官形成等方面起到了支持、引导作用，是组织工程化食道研究的重点和难点。各种不同性质的材料被引入到构建人工食道的研究中，在体外构建食道上皮、肌肉及神经组织，但其相互之间的生理生化作用、组织相容性等方面的问题仍未得到解决。

1.1 天然生物材料

天然生物材料因其普遍存在于生物体内、生物和细胞相容性好等特点，一直受到研究者的关注。运用于组织工程化食道支架材料的天然生物材料，主要包括胶原、壳聚糖、明胶、去细胞外基质等。

Marzaro等将食道平滑肌细胞与同源的小猪食道去细胞化基质体外培养，将其移植在3～4周的小猪食道缺损部位，小猪可以从口腔进食。移植3周后，有炎症反应，无排斥现象。解剖后，运用免疫组化等实验，验证了去细胞支架能够提供平滑肌细胞支撑、黏附等作用［2］。

Badylak等将来自猪小肠黏膜下层（SIS）或膀胱黏膜去除上皮细胞和肌层，制成天然支架，用于犬的食管修复，发现食管的黏膜上皮在35d左右覆盖整个供体，50d后新生血管和肌束形成，2个月内，支架材料被吸收；补片供体未出现狭窄，但管状供体出现狭窄，管径缩小约50％［3］。近期，Badylak研究组的Agrawal等将来源于猪的细胞外基质作为支架，在大鼠腹壁培育神经组织，28d支架上发现成熟、未成熟的神经及施旺细胞，91d在手术后的牛模型中进行食道修复［4］。实验发现，细胞外基质构成的生物支架可以用于构建组织，而神经分布在重建组织中是一个具有重要功能的组成部分。Wei等也利用猪小肠黏膜（SIS），将实验犬口腔上皮细胞体外扩增后，与其形成上皮细胞-SIS复合物。与复合物细胞同源的实验犬手术造成食道缺损，并将该复合物移植到缺损处［5］。实验发现，细胞-SIS复合物实验组无炎症反应，支架材料布满鳞状上皮细胞，细胞-SIS组上发现肌肉组织再生。

Isch等用去细胞化皮肤（AlloDerm）对实验犬进行颈段食管成形术，术后2个月后管壁完全上皮化，无吻合口瘘和狭窄发生，其作为补片状修补、作为管状替代的效果，还未进一步证实［6－7］。Bhrany［8］和Ozeki［9］所在的不同的两个研究组报道了大鼠模型中食道上皮细胞在去细胞化食道支架上的生长情况；在比较脱氧胆酸和曲拉通100两种试剂去除细胞的方法后得出结论，认为去细胞化的理想方法是使用脱氧胆酸，对所植上皮细胞的免疫组化研究也证实了上述结论的可靠性。Urita等报道了胃去细胞基质能够满足食道黏膜的再生，并且未发生狭窄和扩张［10］。

Saxena等运用羊的食道上皮细胞和胶原支架构建细胞-支架复合物，对胶原支架材料上生长的羊食道上皮细胞亚群进行研究与分析［11］，结果是广谱细胞角蛋白（pan cytokeratin，PCK-26）阳性的羊食道上皮细胞亚群适合食道构建及产生。秦雄等在热交联海绵状胶原蛋白-壳聚糖膜上，培养新生牛食管上皮细胞，后植入裸鼠背阔肌表面，2周后食管上皮细胞分化至10层，4周后胶原蛋白-壳聚糖膜被降解吸收［12］。Saito等的实验也证明，胶原蛋白-壳聚糖膜可作为组织工程构建可降解人工食道的基质材料［13］。

在上述研究中，天然材料具有一定的细胞相容性，但是在用于食道组织工程支架时，还存在着诸如去细胞外基质来源有限、胶原等天然大分子易降解、机械强度较弱等缺点。

1.2 高分子材料

高分子材料具有来源广泛、成本低、易造型等特点，很早就被引入到组织工程学研究中。早在1953年，Berman首次应用聚乙烯管构建人工食管进行动物及临床实验［14］，虽然其实验存在诸多问题，但开创了组织工程化的先河。Miki等把胶原蛋白及人鳞状上皮在聚乙烯支架上体外培养扩增，后缝制成有血管肌瓣的组织工程化食道，进行动物实验［15］。虽然聚乙烯为非降解材料，不能被机体吸收，不过这些工作为食道组织工程研究开辟了使用高分子材料的新途径。

聚羟基乙酸（polyglycolic acid，PGA）合成的微乔（Vicryl），是一种水溶性、组织相容性良好的高分子材料，包被上的胶原蛋白可形成管状结构，即Vicryl管。1991年，Purushotham等将 Vicryl管用于猪模型试验中，替换其胸段食道［16］。由于胃酸反流将Vicryl管溶解，发生严重渗漏和纵膈炎。后期采用甲醛交联，提高了Vicryl管抗腐蚀的能力，但仍不能避免狭窄的出现。Shinhar等于1998年也使用同样的方法，构成 Vicryl网重建食道，替换猪颈段食道，虽未出现断端吻合口瘘，但依然未能解决狭窄的问题［17］。

聚乳酸、聚丙交酯等高分子化合物及其聚合物来源广泛，具有可降解性，可塑能力强，力学性能较好，与天然大分子物质相结合增强了组织相容性，成为组织工程化食道支架材料研究的热点。鲍春荣等将犬食道上皮细胞体外扩增后，种植到预涂Ⅳ胶原的聚乳酸-聚乙醇酸［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］三维支架材料上，形成食管上皮-支架复合物，在体外分期终止培养；3天后，体外培养的细胞支架复合物植入细胞来源的同只犬腹腔内，进行体内培养［18］。在对不同时期培养后的复合物进行检测后，发现分离培养的犬原代食道上皮细胞呈铺路石样，体外可大量扩增，体外及体内可见食道上皮在支架材料上黏附、生长良好，持续培养可保持食道上皮细胞特性。在犬腹腔内培养4周后，可形成食道黏膜样组织。竺亚斌等将合成材料（如PLGA、PLLA、PCL、PU）及其共聚物等接枝生物大分子（如层粘连蛋白、胶原蛋白等），比较与食道多种细胞的作用情况，发现接枝后的这些聚合物基材能有效地促进食道的上皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖和功能分化［19－21］，这进一步说明可降解聚合物作为食道组织工程支架基材的可行性。

1.3 镍钛合金

镍钛合金目前被广泛用于骨折等外科手术治疗中，被公认为具有良好的生物相容性。例如谢远才等将镍钛合金与硅胶结合，制成了人造食道［22］；梁建辉等也运用相同的方法制成人造食道，并将其植入两组实验犬体内。结果显示，两组实验均出现人造食道脱入胃内的现象［23］。而且，镍钛合金价格高、不能被人体吸收降解，不符合组织工程学的目的和要求。

2 三维多孔支架的制备

三维支架材料为组织工程化食道组织再生及形状的形成提供了力学支撑，其多孔的特性使支架材料内部相互贯通，利于营养物质的扩散、细胞长入及组织的血管化。构建组织工程三维多孔支架材料的方法很多，如膜材层压、纤维粘合、乳液冷冻干燥、三维打印（粒滤）等［24］。目前，应用于食道组织工程三维多孔支架材料的常见方法主要有：盐粒滤-溶剂蒸发、热致相分离、静电纺丝等。

2.1 盐粒滤-气体发泡法

Benjamin等研究者将大鼠食道上皮细胞培养在合成材料支架和天然材料支架上，比较它们之间的相互作用［25］。其中，合成材料是按不同比例，先把聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸共羟基乙酸合成为聚合物，再将声频筛筛过的碳酸氢铵盐（颗粒大小在38～75μm和150～250μm）以25∶1加入到聚合物溶液中，后经干燥、氯仿酒精浸湿、柠檬酸浸没等步骤使气体发泡-盐粒滤，最终获得多孔支架材料。研究结论是：大鼠食道上皮在合成材料和天然材料支架上都能黏附、增殖，不过在具有成层和正确的微结构合成材料支架上，缺乏正确形态的细胞内层。

盐粒滤-气体发泡法存在很多缺点，如盐颗粒不能完全从合成材料中脱去、溶剂有一定毒性、孔径偏大等，因此在组织工程化食道构建中未被广泛使用。

2.2 热致相分离法

1981年，美国Castro提出一种新的制备聚合物微孔膜的方法——热致相分离法［26］，具有很多传统方法不能比拟的优点：一是可以控制孔隙率、孔径；二是采取不同的制膜条件，可以获得不同结构和形态的孔；三是制膜所用的原材料来源大大增加，不仅能把传统的聚合物膜材料制成微孔膜，还可以把结晶性的、带有强氢键作用的一类常温下没有溶剂的聚合物制成微孔膜［27］。

竺亚斌等利用热致相分离法（TIPS），将自制的具有较好弹性的无规共聚物（L-乳酸-co-己内酯，PLLC）制成具有不对称孔径的三维多孔支架。食道上皮细胞培养14 d后，能在上述支架上形成一连续的上皮细胞层，某些部位甚至多于一层，说明此多孔支架对细胞无毒性，且具有一定的支持上皮细胞生长的作用［28］。进一步模拟食道组织结构，将上皮细胞种植于小孔径表面，将食道成纤维细胞种植于大孔径的支架本体内部，获得了两种细胞在支架上共生长的体系［29］。在支架材料合成和三维支架与食道细胞复合构建方面，获得了重要的实验数据，为组织工程化食道的研究打下了良好的基础。

2.3 静电纺丝技术

Formhals首先设计并制备了第一套静电纺丝加工装置，申请了第一项关于静电纺丝加工的专利［30－31］，并在后来几年内完善了静电纺丝技术［32－33］，使利用静电纺丝技术制备纳米至微米级长纤维成为可能。根据需求调整操作参数和实验条件，制备成不同外形的纤维状聚合物支架材料，其孔隙率和比表面积大、均一性高、孔间连通性好，符合组织工程支架材料的需要，在生物工程领域如制备仿生化和功能化组织工程支架有着广泛的应用［34－35］。

Leong等运用电纺丝技术，将聚（D，L-乳酸）材料制成纳米级多孔纤维支架材料，其纤维平均直径850nm左右，纤维上每平方微米分布16个左右孔隙，将牛血清蛋白吸附在上述多孔支架材料上［36］。猪食道上皮细胞在纤维上种植10～24 h，结果显示，电纺丝纤维纳米级孔能大大增加培养基中小牛血清蛋白的吸收，同时猪食道上皮细胞的黏附率也显著提高。研究者从而认为静电纺丝技术制备的多孔纳米支架材料在食道组织工程中能为上皮细胞提供黏附、增殖和分化的表面。

竺亚斌等对静电纺丝复合纤维的制备及其影响因素进行了探索［37］。将生物相容性良好但机械性能差、降解过快的天然高分子材料（如明胶）与外形和机械性能良好的聚己内酯混合电纺，运用静电纺丝系统在不同实验条件下，制备成直径250～660nm、均匀无珠状物的多孔纤维膜。该研究使两种材料的优点都得以发挥，使纤维膜的食道细胞相容性因明胶的存在而有望得到改善。将L-乳酸和己内酯的共聚物电纺丝后进行纤粘连蛋白（Fn）纤维表面接枝，明显促进了食道上皮细胞的黏附和增殖，培养14d后上皮细胞分泌IV型胶原，显示上皮细胞仍然保持其生物学功能［38］。这些研究为以后成功构建组织工程化食道，奠定了良好的实验基础。

3 组织工程化食道其他方面的研究进展

支架材料研究发展的同时，与食道组织工程密不可分的许多方面研究也有很大进展，如食道组织工程中种子细胞的研究、机械力学和动力学研究等。

3.1 种子细胞

目前，组织工程化食道构建所需的种子细胞多来自成熟的食道组织细胞，进行传代培养可以在支架材料上形成食道组织（如上皮、肌层、腺体等），但随着其传代数的增加和细胞分化增加，增殖逐渐减少，限制了组织工程化食道的寿命。干细胞，包括胚胎干细胞和组织干细胞，是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下可以分化成多种功能细胞。在组织工程领域，组织干细胞已有广泛的研究和探索。2004年，Epperly等从小鼠骨髓分离出食道祖细胞，证明其在受辐照的受体小鼠体内定植并分化［39］。从成体细胞转化获得的胚胎样细胞（IPS），具有干细胞的多能分化能力，避免了胚胎干细胞的获取所涉及到的伦理问题，成为组织工程化食道种子细胞的良好选择［40－41］。存在于羊水中的羊水干细胞，也是一种多能干细胞，在体外培养和移植体内都具有安全性［42］。

干细胞虽然具备很多适于组织工程种子细胞的优点，但来源少、获得困难，储藏、定向分化等方面费用高昂，或许只有各项相关学科的高速发展才能解决上述难题。近些年来，基因组学的发展、基因图谱的绘制，使一些研究者将目光集中在转基因动物上。近10年来，世界各国主要以猪为研究对象，为了克服超急排斥反应，已成功地建立了转基因猪模型。具有人类基因的转基因猪，能降低或克服异种细胞的免疫反应，如果能排除人畜共患疾病，那么异种细胞就有可能用作为种子细胞，应用到包括食道在内的所有器官组织工程中［43］。

3.2 力学研究

Yang等建立了一种三维组织模型，用于描述非线性、不均质生物器官（如食道）的复杂机械性能［44］。在食道肌层和粘膜层的固定轴伸展的膨胀实验中，获得压力-半径-轴向力的实验数据，用于器官模型，得到与结构相关的参数，其中包括胶原蛋白数量和纤维方向。将4参数模型中的双直线应变量应用于6参数模型，能同时捕获3种伸展的膨胀行为。实验发现，肌层和黏膜层的胶原蛋白优先轴向分布，并且黏膜层胶原含量更多，这与单轴抗拉实验结果吻合。研究者认为，这样的模型有望应用于生理状态下的食道壁压力的预测，在构建组织工程化食道力学方面的研究中有一定的参考价值和实践意义。

组织工程化食道应具备一定的机械动力，能和正常食道一样自主蠕动。Watanabe等在人工食道上嫁接了镍钛合金制成的传动装置，成螺旋状排列［45］。在适当的电压和电流下，人工食道自主收缩，收缩全过程与人类食道在X线下观察的蠕动相似，为组织工程化动力学方面的研究提供了支持。

4 展望

鉴于上述组织工程化食道研究的成果，食道组织工程将在今后得到更长足的发展。未来组织工程化食道的研究将首先在种子细胞和支架材料等方面得到突破。

目前，高分子聚合物与天然高分子材料结合，为构建组织工程化食道提供了组织相容性高、便宜且能大规模生产的基材；而静电纺丝等新技术的应用，为制备仿生多孔支架材料提供了技术支持，使支架材料能够为细胞提供更加适宜的环境，利于其生存、繁殖、分化等。蛋白质组学、基因组学、材料学、计算机等各门学科的飞速发展，加速了组织工程化食道种子细胞的选择及培育，增进了组织工程化食道机械动力等方面的研究与探索，为成功构建组织工程化食道打下了坚实的基础，获得了诸多方面的支持。

组织工程化食道的研究已取得了很多世人瞩目的成绩，虽然组织工程化食道成功构建并真正应用于临床还面临许多问题，如支架材料的选择、种子细胞获得及正常繁育生长、机体抗排异反应、伦理等，但具有与食道相同解剖结构和功能的同种异体组织工程化食道将能构建成功，并成为未来食道癌患者食道移植的理想替代物。

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