樊明琴 朱月林 朱茂英 许树成 李焰焰
(1阜阳师范学院生命科学学院,安徽 阜阳 236041;2南京农业大学园艺学院,江苏 南京 210095)
白菜类蔬菜属于十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)芸薹种(B.campestris L.)中的栽培亚种群,是我国重要的蔬菜作物。目前,为进一步提高白菜类蔬菜的品质、抗病虫性和抗逆性等,采用基因工程技术将目的基因导入白菜类蔬菜,在保持其原有优良性状的基础上改良白菜类蔬菜的遗传特性,为白菜类蔬菜遗传育种提供了新技术。但是基因工程技术的应用要求高效的不定芽再生体系,而白菜类蔬菜属于芸薹属离体不定芽再生困难型植物(Lim et al.,1998),这是对其进行遗传转化的主要障碍(张松 等,1997)。随着人们对离体条件下诱导白菜类蔬菜外植体再生植株的机理及影响因素等研究的不断深入,目前,国内外不少学者已有利用白菜类蔬菜的腋芽、子叶、下胚轴、真叶、小孢子以及原生质体等(李曙轩和裘文达,1983;申书兴 等,1999;侯喜林 等,2000;成细华 等,2001;Kang et al.,2002;邢德峰 等,2003)获得再生植株的报道。白菜类蔬菜再生体系的建立已经取得快速发展,现将有关研究进展综述如下。
植物材料的基因型对离体培养的效果有重要影响,不同栽培种之间植株再生能力不同。Dietert等(1982)认为基因型是限制白菜类蔬菜再生的一个重要因素。Murata和Orton(1987)研究指出,调控芽形成的基因可能位于C基因组,白菜类蔬菜(AA基因组)由于缺少C基因组而难于再生。Hachey等(1991)研究发现同属于Canola型的5个栽培种在同一培养基上的再生频率相差不大,均大于40%,但非Canola型的R-500的再生频率不到10%。曹家树等(2000)以杭州油冬儿等7个白菜类栽培种和1个杂交亲本为试材,研究发现青梗类品种的植株再生频率明显高于白梗类品种。张凤兰等(2002a)对从中国和日本搜集到的123个大白菜品种和20个普通白菜(小白菜)品种进行子叶培养,123个大白菜品种中有8个品种无不定芽再生,其余 115个品种再生频率为2.5 %~95.0%不等;20个普通白菜品种中有5个品种无不定芽再生,其余15个品种不定芽再生频率为6.7 %~97.5 %。张松等(2002)以36个不同生态型的大白菜品种为试材,研究了基因型对芽分化的影响,再生频率为0~86.67 %。不同品种之间,芽再生频率差异较大,这与以往文献报道的基因型对植株再生频率有很大影响的观点相一致(Jain et al.,1988;李世军 等,1994)。因此,在试验中应尽量选择植株再生频率较高的基因型材料。
外植体各部分的再生能力有很大差异,因此外植体的选用是影响白菜类蔬菜离体培养再生频率的因素之一。白菜类蔬菜用于转化的外植体较常用的为下胚轴、带柄子叶、子叶等(蔡小宁 等,1995;余小林 等,2001;张凤兰 等,2002b;高红亮 等,2008)。由于具有取材不受季节限制、诱导再生快、转化突变率低等优点,利用这些外植体获得了多个成功的转化。王凌健等(1999)用普通白菜的子叶和下胚轴作外植体诱导分化,子叶的分化频率可达56.3 %,下胚轴为37.0%。其中广泛采用的是无菌种子苗的带柄子叶(于占东 等,2005)。杜虹等(2000)在大白菜离体培养中发现子叶外植体诱导大白菜芽再生比下胚轴好,而带有子叶柄的外植体比不带子叶柄的分化频率高,很可能是由于这一部分外植体包含分化能力较强的原分生细胞和子叶块营养(曹家树等,2000)。
外植体的生理状态对白菜类蔬菜离体再生及转化频率也有很大影响。不同生长期的无菌苗明显影响外植体不定芽再生能力。一般情况下,幼嫩组织比老化组织具有较高的形态发生能力。如普通白菜,3~4 d苗龄的无菌苗,其子叶和下胚轴作外植体,不定芽、苗的再生能力远大于其他苗龄。Zhang等(1998)、张智奇等(1998)、曹家树等(2000)都以4 d苗龄的普通白菜外植体作为试验对象。谢建坤等(2000)认为5~9 d苗龄的外植体可以获得较高的不定芽再生频率,但对于不同基因型、不同的外植体来说,其最佳苗龄也有不同,杭州油冬儿普通白菜以7 d苗龄的子叶对不定芽的诱导效果最佳;高华普通白菜为7 d;香港菜薹为9 d。其机理可能是苗龄短的外植体切面薄壁细胞具有较高的再生能力,而苗龄较长的外植体,其切面细胞已开始分化,细胞分裂能力逐渐降低,故不定芽再生频率低。由此看来,不同品种,不同外植体类型具有不同的最适取材时间。
张松等(2001)发现接种方式对大白菜子叶不定芽再生起着重要作用。朱丽华等(2006)以大白菜的下胚轴为材料,研究了3种不同接种方式对不定芽发生的影响,结果表明,与反插和平放的外植体相比,形态学下端插入培养基的正插方式明显有利于不定芽的再生。接种方式的不同使外植体所处环境不同,可能是插植较平放更能使子叶柄切口端充分接触培养基,吸收外源激素,同时亦能吸收子叶内源激素,有利于芽的再生。
白菜类蔬菜离体培养中普遍用MS为基本培养基。王凌健等(1999)研究发现,降低培养基中浓度有利于减少普通白菜外植体分化过程中愈伤组织的形成。侯喜林和曹寿椿(1994)报道MS培养基中盐浓度降低至原来的1/2倍,苏州青普通白菜外植体的分化率由31.1 %提高到36.7 %。
刘凡等(1997)在大白菜小孢子胚培养中把培养基琼脂含量由0.8 %提高到1.2 %,可以明显促进胚的正常发育,减少畸形玻璃苗和二次分化成苗数量,大大提高成苗率。Zhang等(1998)用不同琼脂浓度的培养基处理大白菜外植体,发现琼脂浓度为1.2 %或1.6 %的培养基比浓度为0.8 %的培养基不定芽再生频率高2~3倍。这可能是高浓度的琼脂含量改变培养基中水分的存在状态,同时培养基中湿度下降,改变了离体再生的小气候从而使再生频率提高。
在白菜类蔬菜离体再生培养中,影响外植体再生频率的主要因素是外源激素的含量(张凤兰等,2002a)。目前在建立白菜类蔬菜不定芽再生体系的报道中,6-BA与NAA的组合最多。高红亮等(2008)在普通白菜两个品种的带柄子叶离体培养中用6-BA 4 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1,不定芽再生频率为81.7 %。很多试验中发现,BA和NAA结合使用优于单独使用的效果。张鹏和凌定厚(1995)在进行菜薹离体植株再生频率研究时发现,培养基中分别使用BA和NAA时,植株再生频率分别为7.8 %和5.5 %,两者同时使用再生频率提高4倍,与前人在芸薹属其他作物的外植体诱导芽器官发生取得的结果类似(Bhalla & Smith,1998)。
近年来有些报道苯基脲型的细胞分裂素TDZ等对诱导不定芽或胚状体的形成比BA有更好的效果(马光 等,2008;李玉玲 等,2008)。卢永恩等(2003)以两种大白菜子叶为外植体,发现TDZ具有比BA更高的细胞分裂素活性,0.25 mg·L-1TDZ+0.5 mg·L-1NAA组合促进作用比2 mg·L-1BA+0.5 mg·L-1NAA组合还要好,且子叶再生频率高、出芽迅速、芽点多。朱月林和李式军(2001)报道在2个日本普通白菜品种中的子叶不定芽再生频率最高,为96.7 %。樊明琴等(2005)对结球大白菜的子叶离体培养时发现,TDZ的不定芽分化率为75 %,6-BA的分化率仅为58.3 %。但是TDZ的浓度不是越高越好,高浓度的TDZ有一定的毒害作用,导致愈伤组织褐化,诱导的不定芽多呈丛生状,不易分离,且芽成苗较困难,出现矮化、叶片卷曲、玻璃化等现象。高浓度BA也不利于植株再生。这表明,特定基因型的特定外植体对不同的细胞分裂素的要求都有一定浓度范围,浓度过高和过低都影响其再生。另外,细胞分裂素必须与一定浓度的生长素配合,生长素浓度过高和过低均不利于植株再生。
在遗传转化过程中,筛选培养基中加入AgNO3作为乙烯抑制剂促进AA基因组作物再生的报道较多(Chi & Pua,1989;张鹏和凌定厚,1995;张松 等,1997;Zhang et al.,1998;吴昌银 等,1999;曹家树 等,2000)。据Zhang等(1998)报道,大白菜离体培养中添加适量的AgNO3能有效促进不定芽的发生,并提高正常不定芽的比率。杜虹等(2000)研究表明,大白菜离体不定芽再生频率从无添加AgNO3的28.2 %提高到添加的71.7 %。吴昌银等(1999)的研究表明,AgNO3在普通白菜子叶的离体再生中是必须的。大多数研究认为AgNO3之所以促进植物培养物的再生,可能是由于 Ag+竞争性结合位于细胞间膜的乙烯受体部位从而抑制乙烯活性,并且干扰乙烯信号传递途径,减轻培养过程中产生的乙烯对不定芽发生及形态建成的抑制作用,从而促进器官发生和体细胞胚胎发生(Chi et al.,1991)。
但当AgNO3浓度超过某一临界值时,对外植体分化反而有抑制作用,导致外植体形成畸形芽,不定芽分化率急剧下降。高武军等(2002)在油菜离体培养上也有类似报道。这可能是由于 Ag+是重金属,浓度太高时会对植物产生毒害作用(Mckeron & Yang,1989)。因而关于AgNO3的作用机理有待深入研究。
影响白菜类蔬菜作物离体再生的各种因素是相互作用的,通过选择适宜的外植体类型和最佳生理时期,改良培养条件等方式,诱导控制其分化和发育的分子开关(molecular switch)的开放等,综合所有的因素进行优化才能获得高效的白菜类蔬菜离体培养再生体系(邢德峰 等,2003)。从总体研究来看,白菜类蔬菜离体再生系统仍不完善,再生频率普遍不高,有关提高白菜类蔬菜离体再生频率和遗传转化率的生理生化机制研究仍需进一步加强。
蔡小宁,佘建明,侯喜林.1995.不结球白菜下胚轴和子叶离体培养再生植株.江苏农业学报,11(4):51-54.
曹家树,余小林,黄爱军,徐淑英.2000.提高白菜离体培养植株再生频率的研究.园艺学报,27(6):452-454.
成细华,戴大鹏,刘凡,姚磊.2001.大白菜真叶的组织培养及植株再生.植物生理学通讯,37(4):310-311.
杜虹,庄东红,黄文华.2000.影响大白菜离体培养再生频率各因素的探讨.汕头大学学报:自然科学版,15(1):45-51.
樊明琴,朱月林,朱丽华.2005.结球白菜高效离体子叶不定芽再生的研究.南京农业大学学报,28(1):20-23.
高红亮,李英,宋玉萍,高素燕,王建军.2008.不结球白菜离体培养与植株再生体系研究.西北植物学报,28(5):963-968.
高武军,王景雪,卢龙斗,孙毅,段红英.2002.硝酸银在油菜基因转化中的影响作用.中国农学通报,18(4):43-45.
侯喜林,曹寿椿.1994.不结球白菜子叶离体培养再生植株.南京农业大学学报,17(3):60-64.
侯喜林,曹寿椿,佘建明,蔡小宁,陆维忠.2000.不结球白菜子叶原生质体培养再生植株.南京农业大学学报,23(4):17-20.
李世军,孟征,李德葆.1994.基因组对芸薹属作物原生质体培养及植株再生的影响.遗传学报,21(3):222-220.
李曙轩,裘文达.1983.大白菜的腋芽组织培养繁殖种子.园艺学报,10(1):41-44.
李玉玲,王三红,刘莉莉,章镇.2008.澳洲青苹离体叶片不定芽再生体系的建立.江苏农业学报,24(1):48-52.
刘凡,李岩,姚磊,曹鸣庆.1997.培养基水分状况对大白菜小孢子胚成苗的影响.农业生物技术学报,2(5):131-136.
卢永恩,李汉霞,叶志彪.2003.两种细胞分裂素对大白菜子叶再生的影响.武汉植物学研究,21(4):361-364.
马光,周波,李玉花.2008.芜菁高频率再生体系的建立及优化.园艺学报,35(6):833-840.
申书兴,赵前程,刘世雄,张成合,李振秋.1999.四倍体大白菜小孢子植株的获得与倍性鉴定.园艺学报,26(4):232-237.
王凌健,倪迪安,王光远,夏镇澳,许政暟.1999.青菜组织培养和转化系统的初步建立.实验生物学报,32(l):93-95.
吴昌银,叶志彪,李汉霞.1999.AgNO3对不结球白菜子叶离体再生的影响.华中农业大学学报,18(l):80-82.
谢建坤,崔海瑞,舒庆尧,夏英武,寿森炎.2000.青菜子叶再生体系的建立.浙江大学学报:农业与生命科学版,26(6):588-592.
邢德峰,李新玲,王全伟,徐香玲.2003.影响大白菜高效离体培养再生的因素.植物生理学通讯,39(5):420-424.
余小林,曹家树,徐淑英.2001.改良菜心离体培养植株再生体系的研究.实验生物学报,34(2):158-162.
于占东,何启伟,牟晋华,康静,王丕武.2005.大白菜组织培养与植株再生研究.吉林农业大学学报,27(4):391-395.
张凤兰,高田义人,徐家炳.2002a.不同基因型对白菜子叶培养不定芽再生的影响.华北农学报,17(3):64-69.
张凤兰,高田畑義,徐家炳.2002b.大白菜子叶离体培养再生植株.园艺学报,29(4):348-352.
张鹏,凌定厚.1995.提高菜心离体植株再生频率的研究.植物学报,37(11):902-908.
张松,魏毓堂,温孚江,傅连海.1997.利用乙烯抑制剂建立结球白菜高频植株再生体系.园艺学报,24(11):94-96.
张松,温孚江,魏毓棠.2001.外植体处理及接种方式对大白菜植株再生的影响.山东农业大学学报,32(1):78-80.
张松,温孚江,魏毓棠.2002.不同基因型大白菜芽分化及激素浓度的优化模型.山东农业大学学报:自然科学版,33(l):7-13.
张智奇,周音,张玉华,钟维瑾,张建军,殷丽青.1998.小白菜子叶诱导不定芽再生植株.上海农业学报,14(2):25-28.
朱丽华,张彩琴,盛晓光,刘正鲁,朱月林.2006.接种方式对大白菜下胚轴离体不定芽再生及生理指标的影响.西南农业学报,19(3):460-464.
朱月林,李式军.2001.TDZ对不结球白菜离体子叶不定芽形成的效应//中国园艺学会.中国园艺学会第九届学术年会论文集.北京:中国科学技术出版社:197-199.
Bhalla P L,Smith N A.1998.Comparison of shoot regeneration potential from seedling explants of Australian cauliflower(Brassica oleracea var.botrytis)varieties.Aust J Agric Res,49(8):1261-1266.
Chi G L,Pua E C.1989.Ethylene inhibitors enhanced de novo shoot regeneration from cotyledons of Brassica campestris ssp.chinensis(Chinese cabbage)in vitro.Plant Science,64(2):243-250.
Chi G L,Pua E C,Goh C J.1991.Role of ethylene on de novo shoot regeneration from cotylendonary explants of Brasssica campestris ssp.pekinensis(Lour.)Olsson in vitro.Plant Physiol,96(1):178-183.
Dietert M F,Barron S A,Yoder O C.1982.Effects of genotype on in vitro culture in the genus Brassica.Plant Sci Lett,26:233-240.
Hachey J E,Sharma K K,Moloney M M.1991.Efficient shoot regeneration of Brassica campestris using cotyledon explants cultured in vitro.Plant Cell Reports,9(10):549-554.
Jain R K,Chowdhury J B,Sharma D R,Friedt W.1988.Genotypic and media effects on plant regeneration from cotyledon explant cultures of some Brassica species.Plant Cell,Tissue and Organ Culture,14(3):197-206.
Kang B K,Kim S Y,Park Y D.2002.Effects of AgNO3,pH,agar concentrations,and dark treatments on shoot induction from cotyledon and hypocotyl explants of Chinese cabbage.Korean Journal of Horticultural Science & Technology,20(4):309-313.
Lim H T,You Y S,Park E J,Song Y N,Park H K.1998.High plant regeneration,genetic stability of regenerants,and genetic transformation of herbicide resistance gene(bar)in Chinese cabbage(Brassica campestris ssp. pekinensis).Acta Hort,459:199-208.
Mckeron T A,Yang S F.1989.Biosythesis and metabolish of ethylene//Davies P J.Plant hormones and their role in plant growth and development.Dodrecht,the Netherlands:Martinus Nijhoff Publ:94-112.
Murata M,Orton T J.1987.Callus initiation and regeneration capacities in Brassica species.Plant Cell,Tissue and Organ Culture,11(2):111-123.
Zhang F L,Takahata Y,Xu J B.1998.Medium and genotype factors influencing shoot regeneration from cotyledonary explants of Chinese cabbage(Brassica campestris L. ssp. pekinensis).Plant Cell Reports,17(10):780-786.