茶树基因组DNA测试方法概述

谭和平，沈兴中，唐祥凯，叶德萍，王 智

（中国测试技术研究院，四川 成都 610021）

1 引 言

核酸是生物体遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，它控制着蛋白质的合成和有机体细胞的机能，在生物的生长、发育、繁殖、遗传和变异等生命活动中占有极其重要的地位，针对茶树遗传的研究归根结底还是DNA分子水平，该文就目前茶树基因组DNA的主要测试方法概述如下。

2 DNA提取纯化技术

由于茶树富含多酚类等次生代谢产物，DNA提取过程中这些产物极易发生氧化，且易与DNA形成复合物，难以获得高质量的DNA。按目前一般植物常用的DNA提取法提取茶树DNA，由于没有进行多酚类化合物的处理使得DNA色素含量较高，难以满足后续DNA分析的纯度要求[1-2]，为此许多文献对茶树基因组DNA提取方法进行了探讨和改良，主要有CTAB法和SDS法两种，它们都在防止多酚类物质氧化、去除色素类物质方面进行了改良，主要集中在样品的研磨过程、抗氧化剂等的选择方面。

2.1 SDS法

朱旗[1]等将茶树叶片进行液氮冷冻，然后捣碎成粉末，并尝试在研磨过程和DNA粗品纯化时加入聚乙烯吡咯烷酮PVP去除多酚类化合物以减少色素物质，结果显示得到了较高质量的DNA，认为PVP能显著降低色素的含量，提高茶树DNA的纯度。但是有文献显示茶树叶片经过液氮冷冻处理后，使得部分茶树细胞核破裂，DNA的降解程度较严重，影响提取的DNA质量[3]，且在研磨过程中茶树叶片细胞中的多酚类物质还是会不同程度地发生氧化褐变[4-5]。后来经过改进，普遍采用将茶树叶片置于研钵中加入液氮研磨的方式，同时添加PVP和一些抗氧化剂如β-巯基乙醇。罗军武[6]等设计并比较了茶树基因组DNA提取纯化的6种方案，主要研究了PVP、液氮以及抽提液饱和酚/氯仿/异戊醇对茶树基因组DNA提取质量的影响，经过比较得出研磨过程中加入液氮和PVP，提取和纯化过程中各用饱和酚/氯仿/异戊醇提取一次最后得到的DNA质量最好。谭和平[4]等提出在研磨过程中除加入PVP和抗氧化剂β-巯基乙醇之外并协同加入Vc，有助于阻止酚类物质的氧化，其最适宜添加浓度为Vc 0.05g/g鲜样。

2.2 CTAB法

高峻[7]等采用改进的CTAB微量提取法，提取液中加入β-巯基乙醇，直接将茶树嫩叶剪碎后进行提取，没有经过液氮处理，也没有进行研磨，结果显示得到了质量较高的DNA。袁长春[8]等提出液氮研磨过程和保温过程是影响DNA提取质量的关键环节，经过改良认为液氮的加入量约为2/5研钵体积，研磨时间约为20～30 min，60℃水浴保温1.5 h为宜。Mahipal Singh[9]等用CTAB法，提取市场上购回的干茶样DNA，效果也不错。黄建安[10]等采用了改良的CTAB和SDS两类方法都获得了较高质量的DNA。

2.3 其他方法

梁月荣[11]等采用植物DNA提取试剂盒（Amershan公司产品）提取得到了质量较好的茶树基因组DNA。但是一般的植物DNA提取试剂盒由于缺乏多酚类化合物的处理步骤，所提取的茶树基因组DNA颜色黄褐，得率低，纯度差，不符合后续的分析要求。

3 DNA浓度定量技术

3.1 紫外分光光度法

紫外分光光度法利用核酸在260 nm波长处有最大吸收峰的特点，通过检测DNA在该波长的吸光值，从而对核酸进行直接定量。但该法并不可靠，要求DNA有相当高的纯度，因为核酸样品中的蛋白质等杂质对核酸的定量有较大影响[12]。

近年来，通过对小分子与DNA相互作用的光谱特性的研究，建立了测定DNA含量的紫外吸收光谱新方法，即通过测定小分子与DNA相互作用的吸收光谱，对DNA进行定量，这类小分子有钌联吡啶配合物[13]、结晶紫[14]、维多利亚蓝[15]、灿烂绿[16]、生物染色剂灿烂甲酚蓝[17]和天青Ι[18]等。

3.2 荧光分析法

荧光分析法是利用DNA对小分子荧光探针的荧光强度的改变从而测定DNA的含量，该法操作简便且灵敏度高，重现性好，取样量少。按原理又分为荧光淬灭测定法、体系能量转移测定法、荧光增强测定法[19]等。

3.3 基于PCR的核酸定量方法

基于PCR技术的原理，现主要有以下几种核酸定量方法，包括终点稀释法、套式PCR、竞争PCR、PCR产物微孔板杂交法、实时荧光定量PCR法等[20]。其中实时荧光定量PCR法特异性强，灵敏度高，是检测生物样品中微量DNA最现成的方法。

该方法整个过程可以实时观测，其原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知DNA模板进行相对定量和绝对定量，按原理又分为TaqMan探针法和SYBR Green I荧光染料法。TaqMan探针法添加了一条5′端带有荧光基团、3′端带有淬灭基团的荧光探针，当探针完整时，报告基团受到淬灭基团的制约，不能发出荧光。探针被分解后，5′端的荧光物质便游离出来，发出荧光。所释放的荧光基团数和PCR扩增产物数是一对一的关系，由此可对模板进行准确定量。该法在原理上更为严格，所得数据更为准确，但由于采用荧光淬灭及双末端标记技术，淬灭难以彻底，本底较高而采用酶外切活性，因此定量时易受酶活性影响。SYBR Green I荧光染料法是SYBR Green I与双链DNA结合后发出荧光，荧光信号强度代表了双链DNA的分子数，通过检测反应体系中的荧光强度，对DNA进行定量，可在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物量，并且由此来推断模板最初含量，这种方法成本更为低廉，实验设计更为简便。

3.4 电化学分析法

电化学发光分析法是近几年来兴起的一种DNA定量方法，是利用DNA与络合物作用后生成新的络合物从而导致络合物峰电流下降，且峰电流或其减小值在一定范围内与DNA浓度成线性关系而建立的。原理是对电极施加一定的电压进行电化学反应，反应的产物之间或与体系中的某种组分进行化学发光，用普通光学手段测量发光光谱和强度，对物质进行定量的一种微量分析强度，从而对物质进行定量的一种微量分析方法，具有灵敏、快速、准确和分析适应性广等特点的一种技术。

3.5 其他方法

此外，还有其他一些方法，如化学放光分析法、共振瑞利散射法、高效液相色谱法、毛细管电泳法等。

4 分子标记技术

分子标记技术具有客观、准确、快速的特点，是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式，能对不同发育时期的个体、任何组织器官甚至细胞作检测，数量极多，遍及整个基因组，多态性高，遗传稳定，不受环境及基因表达与否的限制[21-22]。目前运用于茶树的分子标记方法主要有 RAPD、AFLP、SSR、ISSR 等[23]。

4.1 RAPD标记技术

RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）即随机扩增多态DNA技术，是目前运用最普遍的一种分子标记技术。原理是用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物，对基因组的DNA全部进行PCR扩增，以检测多态性。该技术原理简单，引物设计简便，用一个引物就可扩增出许多片段，实验周期短，能在较短的时间筛选大量样品，成本低，而且不需要同位素，安全性好，适用于自动化操作分析，但它是显性标记，不能识别杂合子位点，且多态性水平较低，实验的稳定性和重复性差[24]。一些研究者[4，7，11，25-26]先后利用RAPD技术对茶树品种的遗传多样性、种质资源等方面进行了研究，表明RAPD可以作为茶树优异种质资源遗传多态性、系统演化和分子鉴别研究的有效手段之一。

4.2 AFLP标记技术

AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）即扩增片段长度多态性技术。原理是基因组DNA经限制性内切酶酶切后，产生大小不同的片段，用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为模板，用含选择性碱基的引物对模板DNA进行PCR扩增，以此来检测多态性。

该技术揭示的多态性高，理论上可产生无限多的AFLP标记，重复性好，但是对DNA模板质量要求高，且操作过程复杂，技术难度大，成本高。近几年AFLP在茶树中也有了较多的应用[27-28]。

4.3 SSR标记技术

SSR（Simple Sequence Repeat）即简单重复序列标记技术。原理根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段。由于核心序列重复数目不同，因而扩增出不同长度的PCR产物，以此检测DNA多态性。

该技术操作简单，重复性好，不仅能够鉴定纯合体和杂合体，而且结果更加可靠，但引物具有物种特异性，开发引物需要了解基因组的序列信息。近几年SSR在茶树中也有了较多的应用[29-30]。

4.4 ISSR标记技术

ISSR（Inter-simple Sequence Repeat）即内部简单重复序列标记技术。原理利用生物基因组常出现的SSR本身设计引物，保证引物与基因组DNA中SSR的5′或3′末端结合，通过PCR反应使位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的DNA片段进行扩增。

该技术操作简单，重复性好，揭示的多态性好，成本低，引物通用性强，不需要预先的DNA测序，可以提供丰富的基因组信息，通常为显性标记，呈孟德尔式遗传，且具有很好的稳定性。

5 结束语

目前茶树相关研究中还缺乏分子水平上的测试方法标准，其中茶树DNA提取是茶树分子水平研究中最基础的工作，也是最关键的一步，所提DNA质量好坏是后续浓度测定、分子标记成功与否的关键，所以尽快建立一套完整的适合茶树DNA提取、纯化流程，可以为后面的茶树分子水平测试奠定良好基础。其次分子标记技术在茶树中的应用尚未成熟，今后应通过方法学原理对分子标记技术进行考察，评价不同标记方法对茶树基因组的适用性，指导今后茶树的相关研究。

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