循环肿瘤细胞检测技术的发展现状及展望

张惠静，毕颖楠，郝敦玲

（第三军医大学医学检验系分析化学教研室，重庆 400038）

1 引 言

肿瘤治疗中是否发生远端转移是指导临床制订治疗方案、判断预后面临的主要问题。随着对肿瘤微转移的深入研究，循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）已成为当前肿瘤学研究的热点，用来揭示肿瘤转移行为、反映肿瘤的侵袭性，从而指导临床个体化治疗并对患者进行预后评估[1-2]。因此，CTCs的检测在临床诊断、抗癌治疗以及开发新型的抗癌药物中占有突出的地位。目前循环肿瘤细胞CTCs已被用来研究多种肿瘤（如结肠癌[3]、乳腺癌[4]、前列腺癌[5]、直肠结肠癌[6]等）的微转移并指导临床治疗。

2 CTCs检测方法

血道转移是肿瘤转移重要的方式之一，绝大多数的肿瘤都通过其脱落细胞进入血液循环进而侵袭其他脏器进行远端转移。因此，在外周血中检测到CTCs是预示肿瘤早期转移（特别是尚未发现微转移病灶时）最直接的方法，在肿瘤早期转移的临床诊断中具有积极的意义。但是，对于数以亿万计的外周血细胞而言，CTCs在外周血中的数量稀少，大约每105～107个单核细胞中才有一个CTCs[7]。因此，发展稳定、灵敏以及特异性高的检测方法是解决CTCs检测问题的关键[8]。现有针对CTCs的检测技术主要包括细胞富集技术和鉴定技术两类。

2.1 细胞筛选/富集技术

由于外周血中CTCs所占的比率极低（常低于1/106），因此首先要对血液样本中的目标细胞进行富集以提高其检出率，增加检测的敏感性。常用的细胞富集技术主要有免疫磁分选、密度梯度离心和细胞过滤等。

免疫磁分选技术（Immunomagnetic Separation，IMS）是基于特异性免疫识别原理的细胞筛选富集技术。它将针对肿瘤细胞膜蛋白的特异性抗体（如EpCAM、Ber EP4、Cytokeratins等）包被于磁珠表面以完成肿瘤细胞的特异性识别，借助外加磁场完成对CTCs的筛选/富集。这类技术最大的优势在于分选过程避免了细胞裂解，从而降低后续鉴定工作中的干扰因素，并可对细胞进行形态学分析。筛选富集模式有阳性分选和阴性分选，也可将两种模式结合，进一步降低血细胞含量，提高富集效率。Hu等[9]成功利用免疫磁分选技术对临床样本中的乳腺癌细胞进行筛选/富集，研究显示，IMS能够有效地富集肿瘤细胞，从而提高样本中CTCs检出的阳性率。目前，市场上商品化的CTCs专用检测仪仅有美国Veridex公司生产的CellSearch系统，该仪器已通过FDA认证，是一项集合了免疫磁分选技术和免疫细胞化学法的分离检测技术，通过在磁珠上固定anti-EpCam抗体特异性的识别、结合靶细胞，在外加磁场的作用下完成肿瘤细胞的筛选/富集，经荧光染料染色后，借助荧光成像技术对结果进行分析，从而完成对CTCs的检测。由于ISM需借助细胞表面特异性标记作为筛选的靶标，因此靶标的表达状况便会影响分析方法的敏感性和特异性。例如，炎症性疾病、生理变化、样本中非肿瘤标志物的表达等因素会造成假阳性的结果，而分离过程中CTCs的丢失、循环中的肿瘤细胞的高度异质性等因素则会造成假阴性的结果。

密度梯度离心法和细胞过滤技术均是运用物理方法富集筛选有核细胞。商品化的OncoQuick离心分离管根据细胞的密度及大小的差异，通过梯度离心将低密度细胞（包括表皮细胞、肿瘤细胞、淋巴细胞、血小板）富集在一起；ISET（Isolation by Size of Epithelial Tumor Cells）分离技术则依据细胞的尺寸对细胞进行过滤，从而筛选/富集肿瘤细胞。由于这两种富集方法是借助细胞的物理特性，因此筛选不具特异性，所富集的细胞中不仅含有肿瘤细胞，还存在不同种类的其他细胞（特别是单核细胞）。因此，在后续工作中进行细胞鉴定时，由于肿瘤细胞的差异表达和基因标志物的非特异性，血液中单核细胞带来的干扰会导致检测结果呈假阳性。

2.2 肿瘤细胞鉴定技术

对外周血样本进行富集处理之后并不能完成CTCs的检测，必须联合应用其他细胞鉴定技术来确定细胞的种类和来源。因此，选用特异性的检测技术或方法对CTCs及其分子进行确认是完成整个鉴定过程的关键步骤。常用的鉴定检测技术包括逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫细胞化学技术（Immunocytochemistry，ICC）、荧光原位杂交技术（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）和流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）等。

逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）以肿瘤和上皮组织中某种物质的mRNA为标志物检测CTCs。由于mRNA标志物不表达正常的外周血细胞，故在外周血中检测到mRNA可以间接提示CTCs的存在。从Kopreski等[10]首次采用RT-PCR检测黑色素瘤患者血浆中酪氨酸酶的mRNA以来，这一方法已广泛用于多种实体瘤的CTCs检测和研究[11-12]。RT-PCR及其各种改进技术是目前检测循环肿瘤细胞最有效的方法，但由于测定过程需破坏CTCs，因此无法对细胞进行形态学观察。此外，RT-PCR是对某个肿瘤标志物的mRNA进行检测，因此取样时上皮细胞污染、假基因干扰、肿瘤标志物在非肿瘤细胞内的非法转录等因素都可造成假阳性结果。例如，CK19可表达于正常人和恶性血液病的病人中，其阳性率分别为3.7%和14.3%。此外，炎症、侵入性的检查或者外科手术均可导致外周血样品的污染，使分析结果呈现假阳性。同时肿瘤细胞的异质性和个体间肿瘤标志物的表达差异也可能造成假阴性结果。为解决这一问题，研究人员采用多标志物联合检测或RT-PCR技术与其他检测技术的联合运用（如Southern印迹、ELISA、MACS等）的方式提高方法的灵敏度与特异性，取得了良好的效果。

免疫细胞化学技术（ICC）和荧光原位杂交技术（FISH）均是在细胞富集的基础上针对肿瘤特异的蛋白或基因进行原位检测，从而对筛选后的细胞完成鉴定。由于肿瘤细胞蛋白/基因表达的不稳定性以及其他正常细胞存在非法表达，因此检测结果的准确性依赖于所检测目标的表达状况。例如，Kahn等用梯度离心法（Ficoll/Hypaque）首先对样品中的细胞进行富集，之后借助抗CK8抗体（CAM 5.2）对富集细胞进行免疫化学染色，结果显示此方法可以在每5mL外周血中检测到5个肿瘤细胞。FISH技术以基因分子探针作为示踪物虽然提高了检测的准确性，但由于基因的差异性表达，分子探针并不能标记所有的靶细胞，因此限制了此技术在外周血样本中检测稀缺CTCs的应用。

流式细胞计数（FCM）是一项集激光、电子物理、光电测量、计算机、细胞荧光化学及单克隆抗体技术为一体的细胞分选和分析技术。此项技术具有分析速度快、精度高、准确度好等优点，可以对外周血样本中的CTCs进行定量计数，还可对细胞的物理、化学特性做多参数测量。然而，流式细胞术检测靶细胞的敏感度仅为1/104，而外周血中CTCs的数量常小于1/106，因此单纯依靠FCM测定CTCs的方法敏感性仍存在争议。通过与其他细胞富集技术（如磁珠富集）联用可对CTCs进行特异性富集，提高方法的敏感性和鉴别力，使CTCs的阳性检出率提高。

由于各种检测技术的局限性和外周血样品的特殊性，使得单纯地依赖特异性的蛋白标志物或基因标志物的分析并不能完成对CTCs的准确分析，必须联合必要的细胞筛选/富集手段提高CTCs的浓度，从而提高分析的准确性和灵敏度。然而，目前的检测技术中，细胞筛选/富集过程和鉴定分析过程相互脱节，即需完成CTCs富集才能进入肿瘤细胞鉴定的过程。这种多步骤、分步式的检测方式受人工操作、样品转移的影响极大，降低了检测方法的灵敏性和可靠性。因此，建立一种集分选、富集和检测于一体的分析技术是提高外周血中CTCs检出率的重要途径。

2.3 微流控分析芯片技术

近年来，随着微流控和微机械加工技术（MEMS）的不断完善和发展，微流控芯片技术在细胞水平上的生物学研究和临床实验诊断等领域里的优势日趋显著[13-14]。微流控芯片又称芯片实验室（Lab-on-a-Chip），该技术是将生物和化学等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成或基本集成在一块几平方厘米的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以取代常规生物或化学实验室的各种功能的一种技术。该技术的基本特征和最大优势是多种单元技术在微小平台上的灵活组合和大规模集成，可以将现行所有的细胞分析步骤和过程（如细胞操纵、细胞捕捉/筛选、细胞培养以及在线实时动态监测分析等）整合于一块微芯片上，实现分析操作的一体化。因此，基于微流控分析芯片技术在细胞分析和研究中所显现的优势，其在CTCs上的应用研究也在积极展开并取得一定进展。Nagrath等[15]在其研究中利用微流控亲和色谱芯片技术实现了对全血样本中CTCs的分离/富集。该研究在一块2.5cm×6.6cm的芯片上，于1.9cm×5.1cm长方形微腔中设置了70 000多个呈等腰三角形排列的微柱结构，其柱高100μm，直径100μm，柱间距50μm，并通过共价结合的方式将抗表皮细胞粘附分子（Anti-EpCAM）抗体固定于微腔中，构成分离/富集区。通过优化流速等条件借助抗原/抗体的亲和作用，实现了毫升级外周血中多种肿瘤CTCs的筛选纯化。研究表明，通过在芯片腔体中设置呈等腰三角形排列的微柱，不但能够增大微结构与细胞接触的比表面积，而且这种构型的微柱结构还有效地避免了剪切力对细胞识别/捕获的影响。随后该研究小组又利用该系统从非小细胞肺癌患者的外周血中分离/富集CTCs，并利用离线的PCR技术完成了其表皮生长因子受体基因（EGFR）的突变分析[16]。但该研究所用芯片以硅作为基片，芯片结构复杂、造价昂贵，其细胞富集的平均纯度只有50%左右。Adams等[17]构建了一个具有51个波浪形微通道阵列的芯片，通道尺寸为长 3.5 cm×宽 35 μm×深 150 μm，将Anti-EpCAM抗体固定于微通道表面，在37min内成功地从全血中分离/富集出人乳腺癌细胞MCF－7，并通过整合的电导传感器，对细胞进行定量计数分析，其捕获率高达97%，纯度近100%。该方法通过阵列化的捕获通道设置，较好地解决了通量问题，但其检测结果采用的是非选择性的电导检测技术。

目前，利用微流控芯片技术进行CTCs检测还在起步阶段，在芯片设计、材料选用、检测技术联用等方面仍存在不足，但此技术的出现却为CTCs检测技术的发展提供了新的方法和思路。

3 发展与展望

综上所述，CTCs的分析是一个多步骤联合的分析过程，细胞筛选/富集技术与肿瘤细胞鉴定技术的联用有助于提高外周血样本中CTCs的检出率，从而更为准确地指导临床治疗。微流控芯片作为新出现的分析平台以其灵活的设计、积木式的功能组装为特点，将细胞筛选/富集功能区与细胞鉴定技术结合，在一张芯片上完成CTCs的检测。这种技术有效地避免了分步操作造成的影响，从而提高了CTCs的检出率。另外，由于芯片系统的设计灵活，在芯片内可设置相应的药物筛选单元，为临床个体化治疗方案提供可能。虽然目前利用此技术完成对CTCs的检测尚不成熟，但不可否认微流控芯片的出现为CTCs的检测和实现临床的个体化治疗提供了新的技术平台。因此，利用微流控芯片系统进行CTCs检测将成为未来CTCs检测研究的重点。如何建立一个灵敏度高、特异性强，能够针对多种肿瘤细胞进行筛选以及将多步骤检测过程实现在线整合的系统是今后微流控芯片系统检测CTCs亟待解决的问题。

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